杨金部常全娥苟萍魏鸿雁

（1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002）

大蒜素及其前药对食管癌细胞生长的影响

杨金部1常全娥1苟萍1魏鸿雁2

（1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002）

通过大蒜素及大蒜素前药处理食管癌Eca9706细胞，观察细胞形态，测定乳酸脱氢酶（LDH）活性和DNA降解。结果表明，癌细胞变圆、变小，活细胞数目减少，脱壁细胞和细胞碎片增多。DNA-Ladder试验结果显示，出现了DNA梯状条带，表明DNA分子发生降解。大蒜素及其前药处理的Eca9706细胞LDH活性显著高于对照组，随处理浓度增加和时间延长，LDH活性依次升高，表现出时间和剂量的依赖性。大蒜素前药处理Eca9706细胞的LDH活性明显高于大蒜素，表明大蒜素前药对细胞膜的损伤程度较大。

大蒜素；大蒜素前药；食管癌；细胞形态；DNA降解

恶性肿瘤已成为人类主要死亡因素，并有进一步增高的趋势。食管癌是食管鳞状上皮的消化道恶性肿瘤，严重危害人类的身体健康，我国是世界上食管癌高发地区［1-4］，每年平均病死约15万人，位居恶性肿瘤死亡率的第4位［5］。目前，应用于肿瘤治疗的大多数药物存在毒副作用较大、敏感性低、疗效不稳定、易复发等问题。因此，从传统中药和天然药物中寻找防治肿瘤的有效成分已成为治疗肿瘤的新途径。

大蒜是亚洲地区人们食用的一种常见调味品，流行病学研究表明长期食用大蒜的人群其癌症发生率低于对照人群，并可以减少胃癌的发生率与死亡率［6，7］。大蒜素（Allicin）是以大蒜鳞茎原料提取的生物活性成分的总称，其主要成分为二烯丙基三硫化物（DATS），是传统用于抗病毒、细菌、真菌等常用药物。近年来发现大蒜素可通过直接杀伤肿瘤细胞及调节机体免疫功能等方式干扰肿瘤生长，在体外能够抑制结肠癌、肺癌、前列腺癌等细胞的增殖，在动物体内对食管癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等也具有明显抑制作用［8-11］，且对正常细胞无毒副作用。大蒜素遇到光、热等条件时都会加速水解反应，导致分子中的二硫键断裂，降解成阿藿烯类（ajoenes）、乙烯基二硫杂苯类（vinyldithiins）和硫醚类（sulfides）等有机硫化合物，导致其生物活性大幅度地降低，严重影响药理作用及疗效［12，13］。大蒜素的前体物质蒜氨酸在蒜氨酸酶催化下生成大蒜素（蒜氨酸和蒜氨酸酶称之为大蒜素前药），大蒜素前药化学性质较稳定，但对其药理活性是否等同于大蒜素还不清楚。本研究用大蒜素及大蒜素前药处理食管癌Eca9706细胞，通过癌细胞形态观察，测定乳酸脱氢酶（LDH）活性和DNA降解，探讨大蒜素前药对食管癌细胞生长的影响，旨在为寻求理化性质稳定、药理活性高的大蒜素替代物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 新鲜大蒜（本地购买）；人食管癌Eca9706细胞株由郑州大学基础医学院董子明教授馈赠，新疆生物资源基因工程重点实验室保存。

1.1.2 主要仪器 组织捣碎机、真空冷冻干燥机、台式冷冻离心机、水浴锅、旋转蒸发仪、UV-1000扫描型紫外可见分光光度计、电子分析天平、全自动高压灭菌锅、CO2细胞培养箱（Heal Force HF240型，China）、倒置显微镜（江南XD-101型，China）、酶标仪（Feic Benchmark Plus型，USA）、细胞培养瓶、离心管、细胞培养板和加样枪等。

1.1.3 主要试剂 （NH4）2·SO4、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、HCl、KCl、NaOH、DTNB、Hepes、巯基乙醇、2，4-二硝基苯肼、L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、丙三醇等均为国产分析纯。

RPMI 1640培养基、0.25%胰酶消化液、10%胎牛血清（均为鼎国公司产品）、青霉素和链霉素（ICN Biomedicals公司）、LDH试剂盒（南京建成生物技术工程研究所）、DNA-Ladder试剂盒（碧云天生物技术研究所）、蒜氨酸（Sigma公司）。

大蒜素提取缓冲液：NaH2PO4-K2HPO4缓冲液（pH6.4）。

蒜氨酸酶提取液：50 mmol/L Na/K磷酸缓冲液（含10%甘油，5 mmol/L EDTA，5% NaCl，0.05%巯基乙醇，pH7.0）。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂的配制

1.2.1.1 0.01 mmol/L PBS（pH7.2） 0.01 mol NaH2PO4、0.01 mol Na2HPO4、0.2 mmol/L NaCl，溶于800 mL蒸馏水，用浓HCl或NaOH调pH值至7.2后，定容至1 000 mL。

1.2.1.2 RPMI 1640培养基 1640培养基干粉一袋溶于500 mL灭菌后的去离子水中，搅拌均匀后定容至900 mL中，用0.45 μm和0.22 μm滤器过滤除菌，4℃分装备用，-20℃长期保存。

1.2.1.3 0.25%胰酶-0.02% EDTA溶液 0.125 g 胰酶、0.015 g EDTA-2Na、0.4 g NaCl、0.02 g KCl和0.05 g葡萄糖粉完全溶解于PBS后，调pH至7.2，定容至50 mL后，用0.22 μm滤器过滤除菌，4℃分装备用。

1.2.2 大蒜素和蒜氨酸酶的提取

1.2.2.1 大蒜素的提取 参照曾哲灵［14］方法，选取完好无损的新鲜大蒜，去皮、洗净、沥干，称蒜瓣100 g，按料液比1∶1（W/V）加入4℃预冷的pH6.4磷酸缓冲液100 mL，用组织捣碎机捣碎，每次10 s，连续3次。取出匀浆液置40℃水浴充分酶解0.5 h，加入95%乙醇，在30℃水浴中提取1.5 h，抽滤，滤液在35℃减压浓缩至10 mL左右，冷冻干燥得到大蒜素干粉。大蒜素含量的测定采用分光光度法［15］，测得大蒜素干粉的得率为2.41 g/kg。置-20℃保存备用。

1.2.2.2 蒜氨酸酶的提取 选取完好无损的新鲜大蒜，去皮、洗净、沥干。称蒜瓣200 g，4℃预冷，按料液比1∶1（W/V）加入预冷的pH7.0磷酸缓冲液200 mL，组织捣碎机中匀浆。匀浆液于4 000 r/min冷冻离心20 min，弃残渣。上清液加入硫酸铵，使饱和度达到20%，4℃静置2 h，8 000 r/min冷冻离心20 min，弃沉淀。上清液继续加入硫酸铵，使饱和度达到50%，4℃静置过夜，8 000 r/min冷冻离心20 min，沉淀冷冻干燥得到蒜氨酸酶。蒜氨酸酶活力的测定采用丙酮酸法［16］，测得酶活力单位为24 720 U/mg。置-20℃保存备用。

1.2.3 样品的预处理

1.2.3.1 大蒜素培养液的制备 称取大蒜素45 mg溶于5 mL RPMI1640培养液，配置成9 mg/mL浓度，过滤除菌。临用前，大蒜素液用RPMI 1640培养液分别稀释至10、15、20、30和 40 μg/mL。

1.2.3.2 大蒜素前药培养液的制备 将30 mg蒜氨酸和15 mg蒜氨酸酶混合，溶于5 mL RPMI 1640培养液，配置成9 mg/mL浓度，过滤除菌。使用前用RPMI1640培养液稀释，稀释浓度同上。

1.2.4 Eca9706细胞培养 Eca9706细胞复苏后，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，加入新鲜的RPMI 1640培养液稀释至2×104/mL，按100 μL/孔接种于96孔板（1.0×105个/孔），于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下静置培养12 h。传代3次，取对数生长期细胞进行试验。

1.2.5 形态学观察 将制备好不同浓度（15、20和30 μg/mL）大蒜素、大蒜素前药按每孔100 μL的量加到培养好的Eca9706细胞中，对照组加等体积的细胞培养液，各组设3个重复孔，于37℃、5% CO2的培养箱孵育48 h，倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.6 乳酸脱氢酶（LDH）活性测定 处于对数生长期的Eca9706细胞按1.0×105个/孔接种于24孔培养板，培养1 d后，分别用低、中、高浓度（10、20和40 μg/mL）大蒜素及其前药在细胞培养箱中处理24、48和72 h，以只加培养基的细胞为空白对照，培养结束时直接收集Eca9706细胞培养液上清，按照LDH试剂盒说明书检测其活性。

1.2.7 DNA-Ladder试验 将处于对数生长期的Eca9706细胞接种于6孔培养板（2.0×106个/孔），培养1 d后分别加入100 μL低、中、高浓度（10、20和40 μg/mL）大蒜素及前药，以只加培养基的细胞为空白对照，48 h后收集细胞，PBS洗涤2次。参照DNA Ladder试剂盒说明书提取DNA，进行2%琼脂糖凝电泳，拍照。

1.2.8 统计学分析 每组试验重复3次，采用Prism统计软件对数据进行两因素方差分析和显著性检验，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 大蒜素及其前药对Eca9706细胞形态的影响

对照组Eca9706细胞平铺贴壁生长，细胞之间排列紧密，多呈椭圆形或棒状，生长状态良好，几乎无脱壁细胞。经不同浓度大蒜素和大蒜素前药处理48 h后，细胞变圆、体积变小，活细胞数目减少，细胞形态呈现不规则形状，脱壁细胞和细胞碎片增多（图1，图2）。

图1 大蒜素处理Eca 9706细胞48 h细胞形态（100×）

图2 大蒜素前药处理Eca 9706细胞48 h的细胞形态（100×）

2.2 大蒜素及其前药对乳酸脱氢酶（LDH）的影响

在正常情况下，细胞内大分子物质LDH 不能通过细胞膜，但在细胞膜受损伤导致通透性增加时，LDH 从细胞膜释放出来，因此LDH 能较好地反映细胞膜损伤程度。在本试验中，低、中、高浓度的大蒜素及其前药处理Eca9706细胞，LDH活性均高于对照组，并具有时间和剂量的依赖性（图3）。除了低浓度大蒜素处理组（24 h）外，其他各处理组与对照组比较LDH活力均有显著差异（P＜0.05）。高浓度大蒜素及前药处理Eca9706细胞（48 h），LDH活性为对照组的3.06和3.77倍。在相同的处理浓度和处理时间，大蒜素前药的LDH活性均大于大蒜素，说明大蒜素前药对细胞膜的损伤更为严重。

图3 大蒜素（A）及前药（B）对Eca9706 LDH活性的影响

2.3 大蒜素及其前药对Eca9706细胞DNA降解的影响

细胞凋亡的特征之一是染色质DNA降解成180-200 bp左右的寡聚核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳中产生特异的梯型的条带［17，18］。大蒜素及其前药处理Eca9706细胞48 h后进行DNA琼脂糖电泳，出现DNA梯状条带（图4），表明Eca9706细胞的DNA分子发生降解，细胞出现凋亡现象。

图4 大蒜素（A）及前药（B）对Eca9706细胞 DNA降解的影响

3 讨论

大蒜制剂具有多方面、多环节的抗肿瘤综合效应，能抑制多种癌细胞生长。大蒜素作为一种高效低毒的天然化合物，目前认为其抗癌作用与抗氧化、诱导肿瘤细胞凋亡、影响细胞周期、免疫调节、阻断致癌物合成、增强肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性等有关［19，20］。大蒜素前药化学性质较稳定，但对其前药功效是否与大蒜素相当，目前的报道较少。我们前期的试验已证明大蒜素及其前药对食管癌Eca9706细胞具有显著的增殖抑制作用，并且大蒜素前药的抑制率高于大蒜素［21］。在本试验中经大蒜素和大蒜素前药处理，Eca9706细胞的形态发生显著的变化，活细胞数目减少。DNA-Ladder试验表明Eca9706细胞的DNA分子发生降解，细胞出现凋亡。乳酸脱氢酶活性测定表明，大蒜素前药对细胞膜的损伤程度大于大蒜素。这些结果说明大蒜素前药在抑制食管癌Eca9706细胞增殖的功效优于大蒜素。大蒜素前药比大蒜素化学性质稳定，因此蒜氨酸和蒜氨酸酶有望成为控制肿瘤生长的天然理想药物。

4 结论

大蒜素及其前药能够抑制食管癌Eca9706细胞的增值，诱导Eca9706细胞凋亡。不同浓度的大蒜素及其前药处理Eca9706细胞，LDH活性均高于对照组，并在一定范围内具有时间和剂量的依赖性，而且大蒜素前药对细胞膜的损伤更为严重。

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（责任编辑 马鑫）

Growth Influence of Allicin and Its Prodrug on Esophageal Cancer Cells

Yang Jinbu1Chang Quan’e1Gou Ping1Wei Hongyan2
（1. College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046；2. Xinjiang Institute of Chinese Medicine and Medicine of National Minorities，Urumqi 830002）

We observed the cancer cell morphology， determined lactate dehydrogenase（LDH） activity and DNA degradation after allicin and its prodrug（alliin + alliinase） treated human esophageal cancer Eca9706 cells. The results showed that the cancer cells became more circular and smaller， the number of living cells decreased， the non-adherent cells and cell debris increased. DNA-Ladder revealed to exist DNA ladder line， which indicated DNA molecule degraded. Cancer cells’ LDH activity treated with allicin and its prodrug was significantly higher than the control group. LDH activity had a time and dose dependent manner with treated concentration increased and time extended. Eca9706 cells’ LDH activity by the prodrug treated was higher than allicin， this confirmed prodrug could cause great damage on cell membrane.

allicin；allicin prodrug；human esophageal cancer；cell morphology；DNA degradation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.034

2014-06-27

新疆自治区高校科研计划（XJEDU02010I13）

杨金部，女，硕士研究生，研究方向：食品工程；E-mail：yangjinbu2010@126.com

苟萍，女，教授，研究方向：生物化学；E-mai：gou__ping@sina.com