隋春红王程董顺福韩丽琴

（1.吉林医药学院药学院，吉林 132013；2.吉林医药学院基础医学院，吉林 132013）

葡萄糖淀粉酶在高压静电纺PEI/PVA纳米纤维膜上的离子吸附固定

隋春红1王程2董顺福1韩丽琴1

（1.吉林医药学院药学院，吉林 132013；2.吉林医药学院基础医学院，吉林 132013）

旨在应用离子结合法将葡萄糖淀粉酶固定在PEI/PVA纳米纤维膜上并对其理化性质进行研究。采用高压静电纺丝技术制备聚乙烯亚胺（PEI）/聚乙烯醇（PVA）纳米纤维膜，采用热交联方法使其具备水稳定性后，再利用离子吸附法固定葡萄糖淀粉酶。结果显示，利用红外光谱（FT-IR）表征固定有葡萄糖淀粉酶的PEI/PVA纳米纤维膜，表明葡萄糖淀粉酶可成功固定在静电纺丝形成的PEI/PVA纳米纤维膜表面。通过固定化葡萄糖淀粉酶的酶学性质鉴定，发现固定化葡萄糖淀粉酶的最适反应温度为65℃，比游离的葡萄糖淀粉酶提高了6℃；固定化葡萄糖淀粉酶的适用pH值范围明显变宽；热稳定性和存贮稳定性显著增强且可以重复使用。利用离子吸附法能简便地将蛋白质分子固定于纳米纤维膜上，具有一定的应用前景。

静电纺丝；PEI/PVA纳米纤维膜；葡萄糖淀粉酶；离子吸附；固定化

葡萄糖淀粉酶（glucoamylase，EC 3.2.1.3）俗称糖化酶，是一种由微生物分泌的胞外酶，可水解淀粉非还原性末端的葡萄糖苷键，产生葡萄糖［1］。作为一种重要的酶制剂，葡萄糖淀粉酶被广泛应用于食品和发酵工业中，且需要量与日俱增。工业生产使用的葡萄糖淀粉酶多为液态酶，具有一定的局限性，如易失活、热稳定性差、酸性反应环境和水解时间长等缺点［2］。因此世界各国科学家对葡萄糖淀粉酶的固定化进行了大量的研究，获得了稳定性强、可反复使用、适于生产的连续化和自动化等多项优点的固定化酶［3］。酶的固定化方法主要有共价键结合法、吸附法、包埋法、交联法等［4］。其中，吸附法因其工艺简单、反应条件温和、载体材料丰富而备受青睐，包括物理吸附和离子吸附两种类型［5］。利用吸附法制备的固定化酶暴露于载体之外，而且酶的空间结构几乎不发生改变。目前，用于固定化酶的载体已达上百种，包括明胶、磁性微球、活性炭、有序介孔材料、硅藻土和亲水性微滤膜等［6］。纳米材料作为一种新型的酶固定化载体越来越受关注，根据物理形态的差异性大致可以分为纳米粒（包括纳米球、纳米囊）、纳米纤维（包括纳米管、纳米线）、纳米膜等［7］。静电纺丝法制备的纳米纤维膜具有比表面积大、孔隙率高和易于分离回收等优点，可以作为一种优良的酶固定化载体，而且制备成本低、工艺简单［8，9］。

本研究采用静电纺丝法制备出携带正电荷的聚乙烯亚胺（PEI）/聚乙烯醇（PVA）纳米纤维膜，热交联使其具备水稳定性后通过离子间相互作用力将带有负电荷的葡萄糖淀粉酶吸附在纳米膜上，达到固定化的目的，同时鉴定固定化葡萄糖淀粉酶的酶学特征，旨在为进一步研究利用新型固定化酶材料和方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

H-7500型场发射环境扫描电子显微镜（SEM）（Japan，HITACHI）；Magna 560型傅立叶红外光谱（FT-IR）仪（USA，NICOLET），其扫描范围为4 000-400 cm-1；UV-2550紫外-可见分光光度计（Japan，SHIMADZU）；高压静电纺丝装置（吉林大学化学学院自组装）；振荡培养箱（上海精密仪器仪表公司）。聚乙烯亚胺（PEI，平均分子量为70 000）购于阿拉丁试剂公司；聚乙烯醇（PVA，聚合度175±50）购于安徽皖维高新材料股份有限公司；50%戊二醛（GA）购于美国Sigma公司；葡萄糖淀粉酶购于苏柯汉（潍坊）生物工程有限公司；可溶性淀粉、乙酸、碘化钾、碘、盐酸、氢氧化钠、硫酸、硫代硫酸钠、碳酸钠等分析纯试剂均购于北京化工厂。

1.2 方法

1.2.1 PEI/PVA复合纤维的制备 将50%（M/M）的PEI溶液和10%（M/M）的PVA溶液按质量比1∶15混合，获得12.5%（M/M）的PEI/PVA溶液，使混合高聚物溶液中PEI与PVA的质量比为1∶3。再将混合高聚物溶液倒入带有电极的塑料管中，调节合适的静电纺丝参数，进行高压静电纺丝。静电纺丝的各项指标参数分别为：工作电压为20 kV，喷口与接收板的距离为10 cm，溶液流速为1.5 mL/h。所制备的复合纳米纤维膜进行热交联（120℃保温12 h）处理，使其具有疏水性后置于真空干燥器中备用。

1.2.2 葡萄糖淀粉酶的固定化 葡萄糖淀粉酶的等电点（isoelectric point，pI）在3.8-5.6之间［2］。将葡萄糖淀粉酶分别溶解于pH为6、7、8和9的磷酸盐缓冲液（PBS）中，使酶分子携带负电荷，以便有效地与带有正电荷的复合纤维膜发生离子吸附。再将疏水性的PVA/PEI纳米复合纤维薄膜浸入不同pH值的葡萄糖淀粉酶溶液（0.5 g/L）中，在25℃的温度下震荡24 h，用PBS（pH为7.4）快速冲洗3遍，真空干燥待测。

1.2.3 酶活力测定 葡萄糖淀粉酶活力单位定义：在pH4.6、温度为58℃时，1 h内葡萄糖淀粉酶水解淀粉释放出 1 mg 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。酶比活力定义：单位重量的游离酶或载酶PEI/PVA纳米纤维膜所具有的酶活力单位数，计量单位为U/g。反应液是由10 mL的质量浓度为2%的淀粉溶液和5 mL的pH4.6的醋酸缓冲液混合而成。在58℃水浴条件下加热10 min后，加入0.5 g载酶PEI/PVA纳米纤维膜，在58℃恒温反应20 min。反应结束后，立刻将反应液置于沸水浴中10 min，终止酶反应。以葡萄糖的含量（mg）为横坐标，540 nm处吸光度值（OD540）为纵坐标绘制标准曲线，生成的葡萄糖量采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定［10］。

1.2.4 酶促反应动力学参数测定 取0.1 g游离酶和0.5 g固定化酶，分别以0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%浓度的可溶性淀粉为底物［S］，按酶活力测定方法测定葡萄糖的生成量，计算出酶促反应速度V。采用Linweaver-Burk作图法（即双倒数作图法），以1/［S］为X轴，1/V为Y轴，经一元线性回归拟合，所拟合直线在X轴上的截距为-1/Km，在Y轴上的截距为1/Vmax，由此求出Km和Vmax。

2 结果

2.1 静电纺丝法制备的PEI/PVA纳米纤维膜

由图1-A展示出PEI/PVA纳米纤维膜在宏观上呈现纤维毯状结构，机械强度优良。PEI/PVA纳米纤维膜的场发射环境扫描电子显微照片（图1-B）显示，PEI/PVA纳米纤维构建出具有三维孔道结构的膜性材料，而且纤维表面平滑、直径均匀（约为600±5 nm），经过热交联处理（图1-C）后，纤维直径有所降低（约为500±5 nm）。在热处理过程中水分的蒸发导致纤维直径减小，从而增加了纤维膜的比表面积和孔隙率，说明经过热交联处理后纳米纤维薄膜表面暴露出更多的功能基团，引起纤维表面对糖化酶的吸附位数量的增加，更加有利于提高纤维薄膜对糖化酶的静电吸附作用。

图1 静电纺丝法制备的PEI/PVA纳米纤维膜

2.2 葡萄糖淀粉酶在PEI/PVA纳米纤维膜上的固定

PEI/PVA复合纳米纤维在3 335 cm-1出现的最大吸收峰归属于羟基（O-H）和亚氨基（N-H）的伸缩振动；2 926 cm-1的吸收峰为甲基（C-H）的不对称伸缩振动；2 865 cm-1较弱的吸收峰为来源于次甲基（C-H）的对称振动；1 660、1 631和930 cm-1两处的吸收峰分别来源于PEI分子中伯胺基团（N-H）的弯曲振动和平面外（N-H）的弯曲振动。而且在1 140 cm-1处出现的吸收峰是PVA晶体化的主要标志，说明经过热交联后制备的复合纤维属于疏水性材料，将更有利于提高葡萄糖淀粉酶的固定化程度和材料的重复使用性能。当把经过热处理的疏水性复合纤维浸入到不同pH值溶液中时，通过红外谱图（图2）可以看出，经过葡萄糖淀粉酶负载后在1 610 cm-1和972 cm-1处出现了新的特征吸收峰，分别归属于酰亚胺基团（-CONH-）和C-S键的伸缩振动；而且在1 515 cm-1和1 505 cm-1出现的另外两个特征峰归属于酰胺中的N-H变形振动，即酰胺化合物的吸收带Ⅱ，这说明葡萄糖淀粉酶已经成功固载于纳米复合纤维膜之上。pH数值越大即溶液的碱性越强，对应的糖化酶的特征吸收峰也越明显，说明在碱性条件下更加有利于葡萄糖淀粉酶的固定化。特别是当溶液的pH 值为9时，特征吸收峰明显变宽且强度增大，这说明葡萄糖淀粉酶与载体之间存在着相互作用。

图2 红外光谱图

2.3 固定化葡萄糖淀粉酶的理化性质

2.3.1 酶活力 以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，测定并计算出回归方程为y=1.840 6x+0.012 8（R2=0.999 8）。分别测定在不同pH条件下制备的固定化葡萄糖淀粉酶的活力、比活力和固化率，结果（表1）显示，酶的固化率随固化环境pH值的增大而增加；此外，与游离的葡萄糖淀粉酶相比，固定化酶的活力明显降低，约为游离酶的1/10。

表1 pH条件下制备的固定化葡萄糖淀粉酶活力、比活力和固化率

2.3.2 最适反应pH和最适反应温度 测定固定化的葡萄糖淀粉酶与游离的葡萄糖淀粉酶在不同pH和温度下的酶比活力。结果发现，游离酶与固定化酶的最适pH基本相同，分别为4.61和4.57（图3）；固定化前后的葡萄糖淀粉酶的最适催化反应温度发生较大改变，游离酶的最适反应温度为59.3℃，与产品说明一致，而固定化酶的最适反应温度为65.1℃，比游离酶提高了约6℃（图4）。固定化酶的适用温度范围和pH适用范围均较游离酶明显变宽，这可能是由于PEI/PVA纳米纤维膜的保护降低了酶对环境的敏感性。

图3 pH对葡萄糖淀粉酶活力的影响

图4 温度对葡萄糖淀粉酶活力的影响

2.3.3 酶促反应动力学参数 根据底物浓度及酶促反应速度作Lineweaver-Burk双倒数曲线图，结果见图5。通过回归方程求得固定化葡萄糖淀粉酶的Km值为17. 82 mg/mL，Vmax为5.33 mg/（mL·h）；游离的葡萄糖淀粉酶的Km值为8.07 mg/mL，Vmax为10.80 mg/（mL·h）。

图5 葡萄糖淀粉酶Lineweaver-Burk双倒数曲线

2.3.4 热稳定性和贮存稳定性 通过在pH4.6的醋酸缓冲液中，分别测定固定化葡萄糖淀粉酶和游离的葡萄糖淀粉酶在不同温度下保持1 h后的酶活力来鉴定其热稳定性。结果（图6）显示，在高温环境下，酶活力均明显下降，但固定化酶的热稳定性要明显优于游离酶。另将一批游离酶溶液和固定于PEI/PVA纳米纤维膜上处于湿态的葡萄糖淀粉酶于4℃贮存于密封的容器中，每隔2 d取出一定量分别测定酶的活力，观察酶活力的降低趋势，鉴定其贮存稳定性。结果（图7）显示，固定化葡萄糖淀粉酶和游离葡萄糖淀粉酶的活力均随着储存时间的延长而降低，但经PEI/PVA纳米纤维膜固定化后的葡萄糖淀粉酶储存稳定性显著提高。储存20 d后，游离酶只能保留初始酶活力的21.61%，固定化酶仍能保持初始酶活力的59.52%。

图6 固定化葡萄糖淀粉酶的热稳定性

图7 固定化葡萄糖淀粉酶的贮存稳定性

2.3.5 重复使用性 衡量固定化酶在工业上是否具有广泛的应用性的一个重要指标就是固定化酶的重复使用性。取反应后的固定化葡萄糖淀粉酶用蒸馏水冲洗3次，以去除表面的底物和产物溶液，然后再在pH值4.6，60℃下重复使用，连续重复使用10次并测定其酶活力。结果（图8）显示，在第3次使用后酶活力开始有一定幅度下降，从第7次使用开始酶活力下降的趋势减缓，在此之后再次使用时能保持在一个稳定的水平，但酶活力偏低。

图8 固定化葡萄糖淀粉酶的重复使用性

3 讨论

与传统纺丝法相比，静电纺丝法制备聚合物纳米纤维具有设备简单、操作容易以及高效等特点，因此被认为是制备聚合物纳米纤维最有效的方法。因此，基于携带大量正电荷的PEI为主体的高分子材料制备纳米复合纤维薄膜可以与带负电荷的糖化酶通过静电作用而结合［11］，从而达到固定糖化酶的目的。通过离子结合法制备的固定化糖化酶可以提高酶的利用率和重复使用性，为进一步研究利用新型固定化酶材料提供依据。

从不同pH条件下制备的固定化葡萄糖淀粉酶活力、比活力和固化率的结果可以看出，酶的固化率随固化环境pH值的增大而增加，这可能是由于在较大pH环境下，酶蛋白所带负电荷较多，与带有正电荷的PEI/PVA纳米纤维膜的吸附结合更加牢固［12］。然而固定化葡萄糖淀粉酶的活力在pH=9时并没有增高，反而降低，说明在过高pH环境下，酶蛋白发生结构上的变化，即酶蛋白发生变性，从而导致酶活力的降低。此外，与游离的葡萄糖淀粉酶相比，固定化酶的活力明显降低，其原因在于固定后的酶分子的活动自由度受纳米纤维膜载体的限制而显著降低。

由酶促反应动力学参数比较发现，固定化葡萄糖淀粉酶Km值＞游离葡萄糖淀粉酶的Km值，并且固定化酶的最大酶促反应速度Vmax＜游离酶的Vmax。这说明固定化糖化酶对底物的亲和力要小于游离酶，即酶的固定化使酶对底物的亲和性降低，这与固定化载体的空间障碍和扩散限制作用有关，即载体限制了酶分子的空间自由度，使酶与底物分子接触受阻。另外一种可能是固定后的酶分子活性中心的空间构象发生变化，影响了酶活性中心对底物分子的定位作用［13］。

固定化葡萄糖淀粉酶的热稳定性和贮存稳定性均优于游离酶，说明酶分子经过固定化后，受到了纳米纤维膜载体的保护作用，一定程度上屏蔽了外界环境对酶蛋白的影响。经重复使用后，固定化葡萄糖淀粉酶活力有所下降，表明薄膜材料随着使用次数的增加，会有少量的酶从纤维膜上脱附下来［14］，随着酶含量的减少，酶活力也随之下降。

4 结论

运用高压静电纺丝技术制备带有大量正电荷的纳米复合纤维薄膜（PEI/PVA），使其作为载体通过正负离子间作用力将葡萄糖淀粉酶固定化。通过扫描电镜和红外光谱进行表征，从而确定复合纤维的形貌及葡萄糖淀粉酶负载后分子的内部结构特征，同时对其理化性质进行研究。结果表明，固定化的葡萄糖淀粉酶保持了较高原酶（游离酶）的活性，同时对游离酶及固定化糖化酶的最适反应温度、最适pH及热稳定性和贮存稳定性进行了比较，研究发现，葡萄糖淀粉酶被纳米复合纤维薄膜PEI/PVA固载后，拓宽了其最适反应条件、提高了酶的利用效率和重复使用性。

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（责任编辑 马鑫）

Immobilization of Glucoamylase onto the Electrospinning PEI/PVA Composite Nanofiber Membrane via Ionic Adsorption

Sui Chunhong1Wang Cheng2Dong Shunfu1Han Liqin1
（1. Department of Pharmacy，Jilin Medical College，Jilin 132013；2. Department of Basic Medical Sciences，Jilin Medical College，Jilin 132013）

It was to study the physical and chemical properties of immobilization of glucoamylase on the PEI/PVA nanofibers via ion bonding. Polyethyleneimine（PEI）/polyvinyl alcohol（PVA） composite nanofiber membrane was prepared by electrospinning technology， and thermal crosslinking was applied to make it possess water stability. Glucoamylase was immobilized onto the electrospinning PEI/PVA composite nanofiber membrane via ion adsorption. Results showed that fourier transform infrared spectrum（FT-IR） indicated that glucoamylase can be successfully fixed on the surface of the electrospinning PEI/PVA composite nanofiber membrane. Then， the enzymatic properties of immobilized glucoamylase were identified. The results have shown that the optimum reaction temperature of immobilized glucoamylase is 65℃， 6 degrees higher than free glucoamylase， and the applicable pH range of immobilized glucoamylase is wider than free glucoamylase significantly. In addition， immobilized glucoamylase also has good thermal stability， storage stability and reusability. The use of ion adsorption can help the protein molecules easily fixed onto the nanofiber membrane， so this method processes a certain application.

electrospinning；PEI/PVA composite nanofiber membrane；glucoamylase；ionic adsorption；immobilization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.025

2014-07-07

吉林省教育厅资助项目（吉教科合字［2013］第354号）

隋春红，女，博士，副教授，研究方向：纳米材料；E-mail：suichunhong@163.com