毕彩红 张秋霞 于珊珊 陈学昭 刘春影 祝茜

（山东大学（威海）海洋学院，威海 264209）

松江鲈（Trachidermus fasciatus）髓样分化因子MyD88基因克隆与组织表达分析

毕彩红 张秋霞 于珊珊 陈学昭 刘春影 祝茜

（山东大学（威海）海洋学院，威海 264209）

髓样分化因子（MyD88）是TOLL样受体介导的信号通路中的一个关键接头分子，通过激活核转录因子（nuclear factor-kappaB，NF-κB）而参与机体的先天免疫。克隆了松江鲈的MyD88基因（命名为TfMyD88），并对该基因进行了生物信息学和表达模式分析。结果显示，TfMyD88 cDNA序列全长1 555 bp，5' UTR长89 bp，3' UTR长599 bp；开放阅读框长度为867 bp，编码288个氨基酸。SMART软件预测TfMyD88分子的N端为一个保守的死亡结构域（death domain，DD），C端存在典型的TIR（Toll/interleukin-1 receptor）结构域。TfMyD88与其它脊椎动物MyD88的氨基酸相似性达57.58%-82.64%，系统进化树分析表明TfMyD88与同属鲈形总目的花鲈和鳜鱼聚在一起，所有鱼类MyD88聚为一支。Real-time PCR检测显示TfMyD88广泛表达于松江鲈各组织，但在鳃中的相对表达量最高；其次为脾脏和皮肤。LPS（lipopolysaccharide）刺激后，TfMyD88在松江鲈的血液、肝脏、皮肤、脾脏均出现明显上调。刺激2 h后，在血液TfMyD88表达量升高了近60倍，在皮肤中的表达量也升高了27倍。上述结果表明TfMyD88可能参与松江鲈先天免疫。

松江鲈；MyD88；基因克隆；先天免疫；LPS

鱼类作为低等脊椎动物，主要依靠固有性免疫（innate immunity）抵抗外来病原微生物感染。固有性免疫是通过模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）特异性地识别病原体的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）来启动的。TOLL样受体（toll like receptors，TLRs）是迄今研究最多的模式识别受体，它们能够特异性地识别PAMPs，并将信号转导入细胞内，引发胞内的级联信号反应，最终活化核转录因子-κB（NF-κB），介导和引发炎症应答［1］。髓样分化因子MyD88是TLR信号转导通路中关键的接头分子［2，3］，由3个功能区域组成。C端为TIR（Tolllike/IL-1 receptor）结构域，该结构域为Toll/白细胞介素-1受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）家族和死亡结构域家族成员所特有。当机体受到刺激后，TLRs会识别并结合相应的PAMP，由此导致TLRs的分子结构发生构象改变，TLRs胞浆中TIR结构域便会与MyD88 C端的TIR结构域相互作用形成TIRMyD88复合体。MyD88 N端是一死亡结构域（death domain，DD），该区域参与胞质信号传导，在肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNF-R）家族的众多成员中也有该结构域。TIR-MyD88复合体形成后，即通过DD结构域招募下游的IRAKs（IL-1 receptor associated kinase，IRAK），使其磷酸化而脱离MyD88，继而与肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）结合，从而启动下游的一系列免疫反应［4-6］。MyD88还有一个连接DD和TIR结构域的中间区域，这一段区域可能参与了IFN-γR信号传导［7］。

目前，已有多个哺乳动物［8，9］、禽类［10］、爬行类［11］等脊椎动物的MyD88分子相继被鉴别。鱼类中斑马鱼（Danio rerio）［12］、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）［13］、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）［14］、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）［15］、条石鲷（Oplegnathus fasciatus）［16］、斜带石斑（Epinephelus coioides）［17］和牙鲆（Paralichthys olivaceus）［18］等的MyD88基因也已被克隆鉴定。

松江鲈（Trachidermus fasciatus）是一种降海产卵洄游鱼类，历史上在我国沿海均有分布。但是近年来种群数量急剧降低，已被列为国家Ⅱ级保护动物。为恢复其自然种群，人工养殖势在必行。然而，养殖过程中各种应激刺激的存在势必会引起各种疾病的出现和蔓延，鉴于这种情况，本实验室已经开展对松江鲈的免疫学研究，从固有性免疫的TLR信号通路入手，已对TLR信号通路中的白细胞介素-1受体相关激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4）和白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）基因的性质和表达模式进行了研究分析［19］。本试验则成功地克隆了松江鲈的TfMyD88全长cDNA序列，并进行了生物信息学分析；应用Real-time PCR技术对TfMyD88在松江鲈10种组织中的表达谱以及LPS刺激后的表达模式变化进行检测和分析，旨在为开展其功能研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 9-10月龄松江鲈，取自山东文登埠口松江鲈自然保护区。在试验开始之前，松江鲈预先在12℃-14℃的循环海水箱中饲养1周使其适应试验条件。选取体重为15-23 g的正常个体，用三卡因甲基磺酸盐（Sigma，St. Louis，MO，USA）麻醉后先用1 mL无菌注射器进行心脏采血，然后解剖鱼体，取其心脏、肝脏、鳃、肠、皮肤、肾脏、脾脏、脑、卵等组织，立即投入液氮，尔后转入-80℃冰箱保存，用于正常组织RNA提取。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒（EZNATMMicro-Elute®total RNAKit II ）为美国QMEGA公司产品，逆转录酶（Reverse Transcriptase M-MLV）、RNA酶抑制剂、dNTP Mixture（10 mmol/L）、T4 DNA Ligase购自TaKaRa Biotechnology产品（日本），Taq酶、PCR mix kit、DL2000 DNA maker为广州东盛生物科技有限公司产品，PCR产物回收Kit购自上海生工生物技术有限公司（下文简称上海生工），引物合成和测序均由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 感染试验 健康松江鲈100尾平均分为2组，一组腹腔注射LPS（lipopolysaccharide）（0.04 mg/kg），对照组以PBS（50 μL/条）取代LPS。刺激2、6、12、24、48、72和96 h后麻醉取样（每个时间点每组取6尾）。首先用无菌注射器心脏取血，然后分别取其肝脏、皮肤、脾脏。将同一组别的相同组织保存在同一冻存管中，投入液氮，再转入-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 总RNA提取及cDNA合成 根据EZNATMMicroElute®total RNA Kit II试剂盒（QMEGA，USA）的操作说明，提取正常组织和刺激后各组织的总mRNA。cDNA的合成具体试验方法参考文献［20］。PCR所用引物（Smart F、Oligo-anchor R）见表1。

表1 本研究所用PCR引物序列

1.2.3 TfMyD88全长的克隆 参照GenBank中已发表的牙鲆（AB241074.1）、条石鲷（HM035064.1）、点带石斑（HM590879.1）、花鲈（Lateolabrax japonicus）（JQ228862.1）、 大 黄 鱼（Larimichthys crocea）（EU978950.1）、 鮸 鱼（Miichthys miiuy）（JQ17835-6.1）、罗非鱼（Oreochromis niloticus）（KJ130039.1）和鳜鱼（Siniperca chuatsi）（HQ014593.1）的MyD88基因序列，用DNAman进行多序列比对，在结合Primer 5.0软件在相对保守的区域设计兼并引物TfMFmiddle和TfMRmiddle。以肝脏cDNA为模板进行PCR，PCR条件为：94℃预变性5 min；94℃变性50 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30次循环；72℃延伸10 min。把纯化的PCR产物与T载体pMD 18-T连接，转入DH5α菌株中送到上海生工测序（测序引物M13-47和RV-M，见表1）。经BLAST得到中间片段后，再根据已知序列设计基因特异性后引物TfMR，与5' primer配对进行5' 末端的克隆；设计基因特异性前引物TfMF，与3' anchor配对进行3'末端克隆，克隆条件同前（上述各引物序列具体见表1）。PCR产物纯化后送上海生工测序，得到5' 末端和3' 末端序列。

1.2.4 TfMyD88序列分析、结构预测和进化树构建

TfMyD88 cDNA氨基酸的翻译和蛋分子量及等电点的预测通过ExPASy（http：//www.au.expasy.org/）完成。通过SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）对蛋白的结构域进行预测。基于BLAST搜查同源序列对TfMyD88在氨基酸水平上进行同源比对和进化树构建，同源序列比对通过ClustalW和BioEdit完成，进化树通过MEGA4.0构建。1.2.5 实时定量PCR（Qrt-PCR）分析 根据已克隆测序的TfMyD88基因设计一对qRT-PCR的引物（QTfF，QTfR），将10正常个组织和刺激后的4个免疫相关组织（血液、肝脏、皮肤、脾脏）的RNA反转录成cDNA作为模板进行qRT-PCR。内参基因为β-Actin，所用引物ActinF和ActinR参考文献［20］。反应体系为10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM，2 μL 1∶50稀释的cDNA，引物各4 μL。使用7300实时荧光定量PCR仪（美国，Applied Biosystems）进行松江鲈基因表达定量。PCR反应条件为：94℃3 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环。每个待测样品cDNA设置3个平行。mRNA相对表达量根据2-ΔΔCt法计算［21］，使用t检验的方法分析差异显著性，P＜0.05为可接受的显著性差异标准。

2 结果

2.1 松江鲈TfMyD88的基因克隆和序列分析

利用兼并引物克隆得到长度为545 bp的cDNA序列，BLAST分析之后显示该片段与鳜鱼的MyD88有较高的同源性。利用基因特异性前引物TfMF和3' -anchor R配对克隆得到TfMyD88 cDNA序列完整的3'末端，长度为591 bp。利用基因特异性前引物TfMR和5'primer配对克隆得到TfMyD88 cDNA序列完整的5'末端，长度为422 bp。利用DNAman等软件对已知中间序列、5' 末端和3'末端序列进行拼接，得到1 555 bp的TfMyD88全长cDNA序列，其中5' 非编码区（5' UTR）长89 bp，3'非编码区（3' UTR）长599 bp，开放阅读框（ORF）长867 bp，编码288个氨基酸（TfMyD88cDNA序列全长和推导的氨基酸序列，见图1），编码的蛋白推测的相对分子质量（MW）为33 103.2，理论等电点（pI）为5.08。利用SMART进行结构域预测，TfMyD88分子包括两个结构域：N端的死亡结构域（DD），C端的TIR结构域。死亡结构域的位置为12-103氨基酸，TIR结构域为152-288氨基酸（图2）。

图1 TfMyD88序列全长及其推导的氨基酸序列

图2 预测结构域示意图

2.2 TfMyD88同源比对和系统进化树构建

将TfMyD88蛋白的氨基酸序列与人（Homo sapiens）（AAB49967.1）、家鼠（Mus musculus）（AAC-53013.1）、斑胸草雀（Taeniopygia guttata）（XP_00-2196761.1）、中华鳖（Pelodiscus sinensis）（ADR742-34.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）（NP_00108100-1.1）、斑马鱼（AAQ90476.1）、鲤鱼（Cyprinus carpio）（ADE20131.1）、虹鳟（CAI48087.1）、青鳉（Oryzias latipes）（XP_004081134.1）、花鲈（AEY83971.1）和鳜鱼（ADM25313.1）的MyD88氨基酸进行序列对比，结果（图3）发现其相似度分别达到57.58%、59.93%、59.00%、58.8%、59.45%、68.51%、68.17%、68.51%、76.74%、78.33%和 82.64%。12个物种TIR结构域同源性更高，尤其是位于其中的box1、box2和box3序列高度保守，而box1中的FDA基序、box2中的“VLPG”和box3中的“FW”基序在各物种均保持不变。

通过MEGA4.0的Neighbor-joining法分析，用重复1 000次的计算方法构建了分子系统发育树。结果（图4）显示，松江鲈TfMyD88与同为鲈形总目的花鲈和鳜鱼的MyD88关系最近，所有鱼类的MyD88单独聚为进化树的一大分支，其他脊椎动物MyD88聚为一支。

2.3 MyD88基因的表达分析

2.3.1 MyD88基因在不同组织中的表达模式 以持家基因β-actin为内参，经qRT-PCR分析（图5）发现，MyD88广泛表达于松江鲈各组织器官。其中，在鳃中的相对表达量最高，其次为脾脏和皮肤。

2.3.2 LPS刺激后TfMyD88的表达模式变化 用qRT-PCR的方法研究了受LPS刺激后，TfMyD88在松江鲈血液、肝脏、皮肤和脾脏中的表达模式变化。结果（图6）显示，TfMyD88在各器官表达均明显上调，但上调模式有所不同。在皮肤中，LPS刺激2 h后，表达量即达到正常时的27倍，之后下调但一直高于正常值。在血液中，2 h时表达量达到正常的60倍，之后表达量快速降低至低于正常，只是在24 h有小幅度的上调，为正常时的1.6倍。在肝脏中，TfMyD88的表达量也在刺激后2 h快速上调，随后慢慢下调，到24 h时恢复到正常水平，但随后表达量发生2次升高，至96 h达到最高值，为正常时的10倍。在脾脏中，于刺激后12 h TfMyD88表达量才缓慢上调到正常时的2.6倍，然后恢复到正常水平，在72-96 h又出现小幅上调。

图3 TfMyD88蛋白序列与其他物种的MyD88的多序列比对

3 讨论

本研究首次成功克隆到松江鲈TfMyD88全长cDNA序列，其中ORF为867 bp，编码288个氨基酸。用DNAman软件分析发现，TfMyD88与其他硬骨鱼的核苷酸序列同源性均在70%以上，其中与鳜鱼的同源性高达82.64%，说明MyD88分子在基因进化过程中保守性较高。这可能是因为MyD88在TLR信号通路中，作为一个关键的接头分子，在机体的先天免疫中发挥重要作用。

图4 基于TfMyD88的系统进化树分析

图5 MyD88基因在松江鲈正常组织的表达模式

图6 LPS刺激后MyD88在松江鲈不同组织的表达模式变化

结构域预测表明，TfMyD88存在N端的死亡结构域、C端的TIR结构域及其中间区域。TIR结构域有137个氨基酸，具有高度的保守性，这与Jault等［12］在斑马鱼中发现的结果相一致，这可能是TLR信号通路中TLRs与MyD88相互作用的结构基础。其中，TfMyD88的box1序列为“FDAFICYCK”，这与其他鱼类有一个氨基酸的差别，松江鲈box1最后一个氨基酸为赖氨酸（K），而其他鱼类该位置是谷氨酰胺（Q），机制有待研究；box2序列为“LCVFDRDVLPGSC”，但box2的第4个氨基酸苯丙氨酸（F）在哺乳动物中却是丝氨酸（S），该氨基酸是否对TIR互作有影响还未见报导。box2中第6位的精氨酸（R）、第7位的天冬氨酸（D）和第11位的甘氨酸（G）残基能形成BB-loop区，在TIR-TIR的相互作用中十分重要［22］。可能正因如此，这3个氨基酸在各物种均保持不变。相对于box1和box2而言，box3的保守性比较低。但是“FW”基序的保守性极高，其在信号转导中是否有重要作用还需要进一步研究。MyD88中间区域的作用已经越来越受到关注，MyD88与干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）诱导产生的细胞因子和趋化因有关［23］，其中参与到该过程的结构域据推测就是中间结构域［7］。TfMyD88的中间区域较哺乳动物少了2个氨基酸，缺失的两个氨基酸是否影响MyD88在松江鲈IFN-γ信号通路中的作用也还需要进一步研究。

qRT-PCR结果显示TfMyD88广泛表达于松江鲈的10种组织，这与之前的研究报道相似，在牙鲆［24］、点带石斑［25］、鮸鱼［26］和半滑舌鳎［15］中均发现MyD88的广泛表达。TfMyD88在鳃中的表达量最高，Tang等［26］对鮸鱼研究发现，其MyD88在肝脏中的表达量最高，通过对牙鲆［24］的研究，其高表达量的组织包括鳃、头肾、皮肤、脾脏和肠。从上述研究结果来看，虽然MyD88广泛分布于动物体内的各器官组织，但是对于不同的物种，不同组织的表达量还是有一定的差异。相对来说，TfMyD88在松江鲈的鳃和血液中的表达较高，可能是因为鳃和皮肤作为机体的第一道物理屏障，首先与病原体接触，TOLL样受体信号路径在此处识别病原体，在免疫监督防御中发挥重要作用。

受LPS刺激后，松江鲈皮肤和血液中的TfMyD88在刺激后2 h表达量迅速上调至最大值；肝脏中也在2 h有一个上调小高峰，在96 h达到最大表达量；脾脏中的TfMyD88是在刺激后12 h达到最大值。条石鲷受LPS刺激后，血液中的MyD88的最高表达量是出现在刺激后的12 h，脾脏的峰值是在刺激后3 h［16］；在牙鲆中，用LPS刺激外周血细胞，MyD88表达上调［24］。MyD88在免疫相关组织中的高量表达以及受到刺激后表达的快速上调都说明其可能在免疫反应中起重要作用。本实验室曾研究发现，受LPS刺激后，松江鲈血液和皮肤中的IRAK4和IL-1β均在刺激后的2 h表达量上调至最大值，二者在肝脏和脾脏中的表达模式也与TfMyD88的表达模式高度相似［19］。这可能是因为与哺乳动物相同，松江鲈MyD88在TLR信号通路中，也是通过招募下游的IRAKs开启免疫应答的。而且，受病原刺激后，TLR信号路径于松江鲈不同的器官中启动时间有所不同。

总之，本研究结果表明MyD88参与松江鲈的先天免疫，对病原的侵染具有快速的应答反应，但是对MyD88参与抗病的机制尚需进一步的研究。

4 结论

本研究首次成功克隆到松江鲈TfMyD88全长cDNA序列，TfMyD88 cDNA全长1 555 bp，编码288个氨基酸。TfMyD88含有两个结构域：死亡结构域（DD）和TIR结构域。TfMyD88广泛表达于松江鲈各组织，但在鳃中表达最为丰富。LPS刺激后，在血液、肝脏、皮肤、脾脏 mRNA表达均明显上调。

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（责任编辑 李楠）

Molecular Cloning and Expression Analysis of MyD88 in Roughskin Soulpin，Trachidermus fasciatus

Bi Caihong Zhang Qiuxia Yu Shanshan Chen Xuezhao Liu Chunying Zhu Qian
（School of Marine Science，Shandong University（Weihai），Weihai 264209）

Myeloid differentiation factor 88（TfMyD88） is a key adaptor protein in the Toll-madiated signaling passway. In this study，we cloned the full-length cDNA from the roughskin soulpin， Trachidermus fasciatus. The full-length of MyD88 was 1 555 bp， which contained an open reading frame（ORF） of 867 bp encoding a polypeptide of 288 amino acids. The deduced amino acid sequence has a conserved death domain（DD） at the N-terminal and a typical Toll/interleukin-1 receptor（TIR） domain at the C-terminal. The mRNA expression patterns of TfMyD88 in healthy and LPS challenged roughskin soulpin were detected using quantitative Real-time PCR. MyD88 was expressed broadly in the blood， heart， liver， gill， intestine， skin， musle， kidney， spleen， brain， with the highest expression in the gill. The expression of TfMyD88 post challenge with LPS（lipopolysaccharide） was detected in blood， liver， gill， skin and spleen. The up-regulation of the expression levels of TfMyD88 in all the detccted tissues after chanllaged by LPS suggests that MyD88 plays an important role in roughskin soulpin defenses against bacterial infection.

Trachidermus fasciatus；MyD88；gene clone；innate immunity；LPS

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.020

2014-06-24

威海市科技攻关计划项目（0000413420608），威海市科委项目（1070432121313）

毕彩红，女，硕士研究生，研究方向：海洋生物学；E-mail：huasa1cu@126.com

祝茜，博士，教授，博士生导师，研究方向：海洋生物学；E-mail：qianzhu@sdu.edu.cn