乔新荣段鸿斌刘柱明赵付安

（1.信阳农林学院，信阳 464000；2.河南省农业科学院经济作物研究所，郑州 450002）

拟南芥PKS2与CAM4蛋白互作研究

乔新荣1段鸿斌1刘柱明1赵付安2

（1.信阳农林学院，信阳 464000；2.河南省农业科学院经济作物研究所，郑州 450002）

植物蓝光受体向光素（phototropin，PHOT）介导许多生理反应，现已从拟南芥中分离了其下游的一些信号转导组分。前期研究表明，拟南芥光敏色素底物 PKS家族成员PKS1与部分Ca2+结合蛋白钙调素（calmodulin，CAM）成员互作，参与PHOT2介导的强蓝光诱导下胚轴向光反应。旨在探讨PKS2和CAM4之间的互作关系，首先用RT-PCR技术得到PKS2和CAM4 的cDNA全长序列。通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术，从体外与体内证实PKS2和CAM4能相互作用。此结果进一步丰富了PKS家族与CAM之间的联系，为深入解析PHOT功能研究奠定基础。

拟南芥；向光素；光敏色素底物；钙调素

植物蓝光受体向光素（phototropin，PHOT）介导植物诸多生理反应，PHOT1单独介导弱蓝光诱导的向光反应及下胚轴伸长的抑制，PHOT2是介导强蓝光诱导叶绿体回避运动的基本光受体［1］。此外，二者以光强依赖方式共同调节植物的向光弯曲、气孔开放、叶绿体聚集运动、叶片伸展及定位等生理反应［1］，使植物适应不同光环境，促进其生长发育。近年来，随着PHOT下游信号成分的分离及功能探索，进一步推动了 PHOT信号转导机制的深入研究。拟南芥中编码光敏色素激酶底物的PKS（phytochrome kinase substrate）是一个小基因家族，共有4个成员PKS1-PKS4，它们最初鉴定是红光受体激酶光敏色素（phytochrome，PHY）的底物，均定位于质膜，参与PHY介导的去黄化、根与下胚轴的生长定位［2-4］。近年来的研究表明，PKS 也参与蓝光受体PHOT介导的生理反应。蓝光刺激增强了下胚轴伸长区PKS1的表达量［5］。PKS1/2与PHOT1/2互作［6，7］，PKS1主要参与PHOT1介导的根和下胚轴的向光反应［5，8］，以及PHOT2介导的强蓝光诱导向光弯曲［7］。PKS2主要在PHOT2信号路径中调节叶片的伸展和定位［6］。

Ca2+广泛存在于植物体内，是植物生长发育和环境刺激应答中心调节子［9］。许多试验表明，Ca2+也参与蓝光诱导的一些生理反应。例如，蓝光诱导了胞质Ca2+的升高［10-12］，且此反应由PHOT介导［11，12］。单侧蓝光照射后的单子叶玉米胚芽鞘的背光面和向光面中Ca2+含量不同［13］。众所周知，生长素在下胚轴的背光面和向光面的不对称分布引起了向光弯曲［14］。但上述的研究表明Ca2+也可能参与PHOT介导的向光反应。钙调素（calmodulin，CAM）是一类真核生物中广泛存在且高度保守的Ca2+感受结合蛋白，拟南芥中7个CAM基因编码4个CAM蛋白异构体（isoform），分别为CAM1/CAM4、CAM2/CAM3/CAM5、 CAM6和CAM7［15］。有证据表明CAM调节生长素极性运输。为了挖掘Ca2+参与向光反应的直接证据，我们之前研究证明PKS1不但与生长素外流载体PIN1直接互作，而且与CAM4/5/7也互作，可能在PHOT2信号通路中参与调节下胚轴向光反应［7］。为了更进一步研究PHOT介导的信号转导路径中PKS家族与Ca2+之间更多的信息联系，本研究利用酵母双杂交（yeast two-hybird）和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BIFC）技术，研究PKS2与CAM4之间的互作关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）DH-5α；酵母菌（Saccharomyces cervisiae）菌株Y190；用于酵母互作的质粒载体pAS2和pACT2，用于双分子荧光互补的载体YFPC和YFPN均为本实验室保存。

1.1.2 试剂及试剂盒 限制性内切酶、Oligo（dT）、核酸分子量标准（Marker）、DNA凝胶纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；高效连接试剂盒Soultion I、M-MLV反转录酶购自Promega公司；KOD-plus DNA聚合酶购自ToYoBo公司；抗生素氨苄青霉素（Amp），醋酸锂（LiAC），鲑鱼精DNA，PEG，X-gal及所用分析纯购自Solarbio公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、普通PCR buffer购自TIANGEN公司。

1.1.3 引物 酵母双杂交试验引物如下所示（下划线是酶切位点）：

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA的合成 以拟南芥幼苗为材料，利用Trizol 法试剂说明书提取总RNA。参照M-MLV反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链，立即使用或-20℃保存备用。

1.2.2 载体构建 根据TAIR网站上提供的PKS2及CAM4的CDS序列，选择体外互作的GAL4酵母双杂交系统。利用PKS2为诱饵蛋白，CAM4为捕获蛋白，用PrimerPremier5.0 设计引物，以PF1和 PR1为引物构建PKS2-pAS2载体，以CF1和CR1为引物构建CAM4-pACT2载体。利用PF2和 PR2为引物构建BIFC试验中的PKS2-YFPC载体，CF2和CR2为引物构建CAM4-YFPN载体。

以制备好的cDNA为模板，利用上述引物分别扩增PKS1及CAM4基因序列，先利用普通Taq DNA聚合酶预扩增预期片段，再用高保真酶KODPlusDNA聚合酶，扩增回收。扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55-57℃复性40 s，72℃（68℃）延伸1-1.5 min，30个循环；72℃（68℃）延伸10 min。

然后将扩增产物回收纯化，用相应的限制性内切酶对基因片段和载体酶切，回收后16℃连接4 h，将连接产物通过热激法传入到大肠杆菌DH5α，并涂布在含60 μg/mL的氨苄青霉素（Amp）抗性的LB培养基上选择培养。菌落PCR和质粒PCR后，进行酶切验证后，得到相应的重组克隆质粒送上海生工测序。

1.2.3 体外酵母双杂交试验

1.2.3.1 酵母感受态细胞的制备及转化 参照Gietz和St Jean［16］的醋酸锂法进行。将30℃培养条件下获得OD≈2.0的50 mL酵母菌（Y190）液室温下3 800 r/min离心5 min。然后重悬于25 mL水中，1 000 r/min离心5 min，得沉淀的细胞重悬在900 μL水中，13 000 r/min离心1 min。用0.1 mol/L LiAC重悬沉淀细胞，使其最终体积为1 mL，30℃温育10 min。然后每100 μL 分装至1.5 mL EP管中，离心后，向沉淀细胞中依次加入 240 μL 50% PEG，36 μL 1 mol/L LiAC，50 μL鲑鱼精DNA，及各5 μL的两个不同质粒，补水至360 μL。旋涡器上剧烈重悬细胞，然后置于30℃恒温箱中温育30 min，再置于42℃恒温水浴池中热激30 min，12 000 r/min离心1 min，弃上清，加适量灭菌ddH2O，轻轻重悬细胞。取20-200 μL涂于SD板上。

1.2.3.2 β-gal阳性克隆的显色反应 当30℃恒温培养箱中的酵母克隆直径约为2 mm时，剪大小合适的尼龙膜，并作上标记，用镊子轻轻挤压在菌落表面，使克隆菌落粘至尼龙膜上。当尼龙膜完全浸湿后，取出用液氮冷却10 s，室温解冻，再冷却，反复2-3次。用Z-buffer/X-gal溶液浸湿滤纸并置于洁净的培养皿中。把菌落裂解好的尼龙膜贴于浸湿的滤纸上。置于30℃培养箱孵育，8 h前不时检查蓝色反应的出现。

1.2.4 BIFC试验 参照Walter 等［17］方法，利用PEG介导的瞬时转化法进行。取数个生长健壮的拟南芥叶片，切成细条，黑暗条件下，酶解细胞壁，离心收集原生质体，用冰冷的W5（154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，5 mmol/L葡萄糖，0.03% MES，pH5.8）溶液轻柔洗涤。重悬后23℃，100×g离心1 min。弃上清，然后每管沉淀用0.5 mL MMg（15 mmol/L MgCl2，0.1% MES，0.4 mol/L 甘露醇，pH5.6）溶液重悬。每种质粒取约10 μg于1.5 mL EP管中，加100 μL重悬的原生质体，轻轻混匀。然后加入110 μL PEG/Ca（1 g PEG4000，0.75 mL H2O，0.625 mL 0.8 mol/L甘露醇，0.25 mL 1 mol/L CaCl2）溶液，轻柔混匀。室温避光静置20-30 min。加入1 mL W5溶液，混匀。在23℃，弱光条件下孵育12-18 h。然后常温下100×g离心2 min，取50 μL左右溶液于小塑料器皿中，静置片刻用激光共聚焦显微镜观察荧光。

2 结果

2.1 酵母双杂交试验重组载体的构建

用Trizol方法提取拟南芥幼苗RNA，以反转录的cDNA为模板，PCR扩增到1 329 bp的PKS2及480 bp的CAM4 CDS序列（分别如图1，2所示的1号电泳条带）。用Sma I和BamH I限制性内切酶双酶切PKS2序列片段，以及pAS2质粒载体，得到重组菌落，挑单菌落进行过夜LB液体培养，提取质粒进行PCR和酶切（图1中2号条带）。用Nco I和Xho I限制性内切酶分别双酶切CAM4基因片段和pACT2质粒，结果如图2所示。将得到的PKS2-pAS2和CAM4-pAC2重组质粒送公司测序鉴定。

图1 PKS2- pAS2载体构建

图2 CAM4-pACT2载体构建

2.2 PKS2和CAM4酵母互作分析

为了检测PKS2和CAM4蛋白是否相互作用，将PKS2构建到诱饵载体pAS2上形成PKS2-pAS2重组质粒并测序正确；将CAM4构建到pACT2上得到CAM4-pAS2重组质粒并测序正确。将PKS2-pAS2与CAM4-pACT2质粒、PKS2-pAS2与pACT2质粒、CAM4-pACT2与pAS2质粒共转化酵母Y190中，同时将阳性对照［18］PHOT1-pAS2与NPH3-pACT2及阴性对照pAS2/pACT2分别共转化酵母Y190，并涂布于SD平板上。30℃培养2-4 d后，挑选菌落转接至YPD板上继续生长2-4 d。进行β-gal 染色，结果（图3）显示，只有阳性对照和PKS2-pAS2/ CAM4-pACT2变蓝，而其他不变蓝，说明PKS2-pAS2和CAM4-pACT2单独不能激活报告基因，只有PKS2-pAS2和pACT2-CAM4之间相互作用具有了转录激活活性。从而证明PKS2和CAM4蛋白存在相互作用。

图3 PKS2与CAM4的酵母互作试验

2.3 BIFC试验载体构建

利用测序正确的PKS2-pAS2质粒为模板，用引物PF2、PR2及KOD-plus DNA 聚合酶 PCR扩增去掉终止密码子的PKS2全长，将回收的目的条带及YFPC空质粒载体分别利用BamH I和Sma I酶切，得到重组质粒PKS2-YFPC，双酶切重组质粒电泳条带如图4所示。以测序正确的CAM4-pACT2为模板，利用引物CF2、CR2及KOD-plus DNA 聚合酶 PCR扩增去掉终止密码子的CAM4全长cDNA，用BamH I和Sma I双酶切回收的目的条带及YFPN质粒载体，将构建的重组质粒CAM4-YFPN酶切验证（图5）。将酶切验证正确的PKS2-YFPC和CAM4-YFPN重组质粒送公司测序。

图4 PKS2-YFPC载体构建

图5 CAM4-YFPN载体构建

2.4 PKS2和CAM4体内互作分析

为了进一步在植物体内验证PKS2和CAM4的相互作用，采用BiFC试验，将构建好的表达载体质粒PKS2-YFPC和CAM4-YFPN、阴性对照YFPC/YFPN及阳性对照［19］PHOT1-YFPC/ PHOT1-YFPN，通过PEG介导瞬时转化法，共转拟南芥原生质体，弱光处理12-18 h后，利用激光共聚焦观察，阴性对照YFPC/YFPN未观察到黄色荧光，而阳性对照PHOT1-YFPC/ PHOT1-YFPN和PKS2-YFPC/CAM4-YFPN观察到了质膜上有黄色荧光（图6），说明PKS2和CAM4在细胞质膜上互作。

3 讨论

近年来，蓝光受体PHOT介导生理反应的信号转导机制研究已成为热点之一。现已分离了多种PHOT下游信号蛋白［1，20］，但由于同源蛋白激酶受体PHOT1和PHOT2信号转导途径的交叉及特异性特点，使得对其下游信号蛋白功能的研究更为复杂及多样性。例如，在研究PHOT介导的下胚轴向光弯曲反应中，NPH3蛋白是PHOT1、PHOT2下游共有信号，与二者生理互作，但RPT2蛋白仅与PHOT1互作，PP2A蛋白与PHOT2特异互作调节向光弯曲，PKS家族中，PKS1/2都与PHOT1/2互作，但PKS2侧重于PHOT2介导的叶片伸展和定位。另外，PHOT信号与光敏素信号、生长素信号及Ca2+信号也存在关联。因此，对PHOT信号转导机制的研究还需进一步深入，尤其是与Ca2+信号互作的直接证据还很有限。前期工作研究表明，PKS家族中PKS1与Ca2+信号感受蛋白CAM4/5/7互作可能参与强蓝光诱导PHOT2调节下胚轴向光弯曲。本研究利用酵母双杂交和BIFC试验证明PKS2能与CAM4互作。为了证明二者互作的准确性，下一步可制备PKS2抗体，利用免疫共沉淀方法进一步验证二者互作关系。另一方面，进一步分析PKS2与CAM5、CAM6、 CAM7的互作反应，为PKS家族作为PHOT与Ca2+信号的中间介导子功能奠定基础。

图6 PKS2与CAM4的BIFC互作试验

4 结论

本研究通过RT-PCR方法克隆获得了拟南芥PKS2与CAM4的完整编码序列，成功构建了用于酵母双杂交系统及双分子荧光互补试验的PKS2和CAM4表达载体，并进行了PKS2和CAM4蛋白的互作试验。结果表明，二者能直接相互作用。

［1］Christie JM. Phototropin blue-light receptors［J］. Annu Rev Plant Biol， 2007， 58（6）：21-45.

［2］Lariguet P， Boccalandro HE， Alonso JM， et al. A growth regulatory loop that provides homeostasis to phytochrome A signaling［J］. Plant Cell， 2003， 15（12）：2966-2978.

［3］Molas ML， Kiss JZ. PKS1 plays a role in red-light-based positive phototropism in roots［J］. Plant Cell Environ， 2008， 31（6）：842-849.

［4］Schepens I， Boccalandro HE， Kami C， et al. PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE 4 modulates phytochrome-mediated control of hypocotyl growth orientation［J］. Plant Physiol， 2008， 147（2）：661-671.

［5］Lariguet P， Schepens I， Hodgson D， et al. PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE 1 is a phototropin 1 binding protein required for phototropism［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103（26）：10134-10139.

［6］Carbonnel M， Davis P， Roelfsema MRG， et al. The Arabidopsis PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE 2 protein is a phototropin signaling element that regulates leaf flattening and leaf positioning1［J］. Plant Physiol， 2010， 152（3）：1391-1405.

［7］Zhao X， Wang YL， Qiao XR， et al. Phototropins function in highintensity-blue-light-induced hypocotyls phototropism in Arabidopsis by altering cytosolic calcium［J］. Plant Physiol， 2013， 162（3）：1539-1551.

［8］Boccalandro HE， De Simone SN， Bergmann-Honsberger A， et al. PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE1 regulates root phototropism and gravitropism［J］. Plant Physiol， 2008， 146（1）：108-115.

［9］Hepler PK. Calcium：a central regulator of plant growth and development［J］. Plant Cell， 2005， 17（8）：2142-2155.

［10］ Babourina O， Newman I， Shabala S. Blue light induced kinetics of H+and Ca2+fluxes in etiolated wild-type and phototropin-mutant Arabidopsis seedlings［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99（4）：2433-2438.

［11］ Baum G， Long JC， Jenkins JI， et al. Stimulation of the blue light phototropic receptor NPH1 causes a transient increase in cytosolic Ca2+［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1999， 96（23）：13554-13559.

［12］ Harada A， Sakai T， Okada K. Phot1 and phot2 mediate blue light-induced transient increases in cytosolic Ca2+differently in Arabidopsis leaves［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003， 100（14）：8583-8588.

［13］Gehring CA， Williams DA， Cody SH， et al. Phototropism and geotropism in maize coleoptiles are spatially correlated withincreases in cytosolic free calcium［J］. Nature， 1990， 345：528-530.

［14］Esmon CA， Tinsley AG， Ljung K， et al. A gradient of auxin and auxin-dependent transcription precedes tropic growth responses. Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103（1）：236-241.

［15］McCormack E， Tsai Y， Braam J. Handling calcium signalling：Arabidopsis CaMs and CMLs［J］. Trends Plant Sci， 2005， 10（8）：383-389.

［16］Gietz D， St Jean A， Woods RA， Schiestl RH. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells［J］. Nucleic Acids Res， 1992；20（6）：1425.

［17］Walter M， Chaban C， Schütze K， et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation［J］. Plant J， 2004， 40（3）：428-438.

［18］Inada S， Ohgishi M， Mayama T， et al. RPT2 is a signal transducer involved in phototropic response and stomatal opening by association with phototropin 1 in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Cell， 2004， 16（4）：887-896.

［19］ Kaiserli E， Sullivan S， Jones MA， et al. Domain swapping to assess the mechanistic basis of Arabidopsis phototropin 1 receptor kinase activation and endocytosis by blue light［J］. Plant Cell， 2009， 21（10）：3226-3244.

［20］ Kong SG， Wada M. New insights into dynamic actin-based chloroplast photorelocation movement ［J］. Molecular Plant， 2011，4（5）：771-781.

（责任编辑 李楠）

致 谢

近期为本刊审稿的专家（按姓氏的汉语拼音顺序排列）

白志辉包永明才 华陈 芳陈 杰陈守文 陈受宜陈信忠

陈叶福崔金杰丁少雄丁 卫高彩霞龚春梅龚国利郭安源

郭远强韩 霄侯丙凯胡章立华 中姜卫红金显春寇晓虹

李春梅李丹花李 林李 强李淑英李铁松李彦芹李越中

梁克红梁元存廖红东林 晨林 鹏林榕姗刘 斌刘纯杰

刘光清刘青林刘维全刘永杰刘忠华娄永根路福平马春玲

茆振川莫照兰潘 力曲娟娟任文华石放雄宋关斌宋 渊

谭钟扬汤 华陶 妍田朝光田 健田 沈王光华王晓英

王 艳王幼平王云龙王占新王志钢王子玉卫亚红武书庚

向军俭谢志雄辛嘉英邢 婧邢秀梅徐 进徐妙云徐书景

徐田军徐玉泉闫茂仓杨官品应杰政喻德跃袁杰利袁志明

张 彬张春宝张凤英张海文张俊杰张 莉张芃芃张 伟

张 兴张永山张宇宏赵国柱赵仲麟郑青松仲寒冰周 波

周 琪周志刚朱玲玲朱 祯庄飞云訾 金

Research of PKS2 Interaction with CAM4 in Arabidopsis thailana

Qiao Xinrong1Duan Hongbin1Liu Zhuming1Zhao Fuan2
（1. Xinyang College of Agriculture and Forestry，Xinyang 464000；2. Cash Crop Research Institute， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002）

Blue-light receptors phototropin （PHOT）mediate a wide set of physiological and developmental responses. As some PHOT downstream signal transduction components have been identified in Arabidopsis by genetic analyses， we have found that PKS1 of Phytochrome kinase substrate PKS family interacts with members of calmodulin （CAM）， which are Ca2+binding protein. In order to address the issue of how PKS2 interacts with CAM4， firstly cDNA full length sequences of PKS2 and CAM4 were obtained by RT-PCR technique. Then， it was confirmed that PKS2 could be interact with CAM4 by tests of yeast two-hybrid system and bimolecular fluorescence complementation. These date could contribute to enrich relation between PKS and CAM， which would provide base for further uncovering PHOT functions.

Arabidopsis thaliana；phototropin；phytochrome kinase substrate；calmodulin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.013

2014-07-28

乔新荣，女，博士，讲师，研究方向：植物分子育种及植物生理；E-mail：xirong806@163.com

赵付安，男，博士，研究员，研究方向：植物分子育种及植物生理；E-mail：fazcotton@163.com