捕食线虫性真菌培养基筛选及优化

2015-10-26向攀

中国畜牧兽医文摘 2015年2期

关键词：生长率孢菌麸皮

向攀

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州　730000）

捕食线虫性真菌培养基筛选及优化

向攀

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730000）

为了弄清少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）的最佳条件生长条件，文章对从实验室中筛选出的一株具有高捕食能力的菌307进行了培养基、温度、pH三方面研究。结果表明该菌最优化的培养基为：06WSA，培养条件pH=7.0，温度25℃。

捕食线虫性真菌生物防治培养基pH值温度

寄生虫对家畜的危害十分严重，急需采取一种安全生态的防治方式。迄今为止，已发现杀线虫性真菌（nematode-destroying fungi）200多种。近几年来，我国在这一领域的研究也取得了大量成果，如杨晓野等人成功地分离鉴定了少孢节丛孢菌并对其生物学特性进行了深入研究，另外蔡葵蒸教授对其捕食情况及工艺培养也做了较全面研究。研究捕食线虫真菌最佳培养条件，是开展用捕食线虫性真菌防治寄生性线虫的重要前提。本研究拟对捕食线虫性真菌A.oligospora的培养基、pH值和温度对其生长的影响做报道，为今后利用捕食性真菌开展动物线虫病的生物防治研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验材料

菌种：从实验室中筛选出的一株具有高捕食能力的少孢节丛孢菌，命名为307。

主要实验用品：实验药品：玉米，麸皮，琼脂，蛋白胨，蒸馏水，1mol/L的NaOH和HCl溶液。

仪器及玻璃器皿：天平、移液管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗、手术刀、酒精灯、电热鼓风干燥箱、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、隔水式恒温培养箱、倒置显微镜。

1.2实验方法

1.2.1培养基组分及浓度的影响

称取新鲜过筛的玉米粉（麸皮粉）320 g，加蒸馏水1 000 ml，微火煮沸1 h 后，补足蒸馏水至1 000 ml，混匀，用多层纱布过滤。取滤液10 ml，加蒸馏水990 ml，沉淀24h；再配成浓度为0.4 g/L玉米，0.4 g/L麸皮，0.6 g/L玉米，0.6 g/L麸皮及玉米和麸皮按照1：1、1：2、1：3、1：4、1：5的组分配制。

（注：实验组其他同学研究得出在0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L中 0.4 g/L和 0.6 g/L 生长较好，是在此基础之上设定的培养基条件。）

1.2.2不同初始pH值对菌丝生长率的影响

在第1组所选出的最有培养基的基础上，设置不同初始pH：pH值定为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0共11个梯度。

1.2.3不同温度对少孢节丛孢菌菌丝生长率的影响

在第2组的基础上，设置不同培养温度：培养温度分别为15℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃共4个梯度。

2　真菌培养

上述各种培养基配制后于121 ℃全自动高压灭菌20 min，倒平皿，将培养基倒置。每类型设置3个平行，标记好各平皿。实验重复1次。将菌丝连同琼脂按比例尺切成5 mm ×5 mm的小块，接入制备好的固体培养基中。每日定时观察菌生长情况，测量其生长率，用mm/d单位表示。每个组接种3个培养皿，试验重复1次，直至长满平皿。

3　结果与分析

3.1不同基质对菌丝生长率的影响

由图1可见：混合培养基和单一培养基促生长速度0.6 g/L ＞ 0.4 g/L；同浓度下促生长速度WSA＞CMA效果相对理想。试验创新性的使用麸皮培养基的优势是成立的。

3.2不同pH对真菌生长率的影响

由图2，菌丝生长适宜的初始pH值范围是6.5～8.0，在该范围内，菌丝产量都较高；其中pH值为7.5时生长率达到5.5 mm/d；pH=7.0时为5.4 mm/d次之；pH值小于5.5或大于8.0时，菌丝生长率急速下降。

3.3不同温度对菌丝生长率的影响

由图3可知：不同温度情况下菌丝生长速率不同，25 ℃最好，其次是20 ℃，大于或小于这个温度，菌丝生长速率相对较缓。

4　培养基正交试验优化

在单因素实验的基础上，进行正交实验设计，选取不同培养基基质（CMA：WSA）（0.41：4、0.61：5、06WSA）、温度（20℃、25℃、30℃）、pH（7、7.5、8）3个因素进行，L9（34）正交试验以优化培养基组成，正交结果见表1。

由正交试验结果方差分析表可知：最佳组合为A3B2C1，即优化培养基为：o6WSA，pH=7.0，培养温度=25 ℃。从结果极差得出影响307的因素大小为：RC＞RB＞RA，即pH＞温度＞培养基质。

5　加幼虫液观察菌的捕食情况表

做培养基06WSA，初始pH=7.0，06WSA琼脂培养基上培养好的菌丝连同琼脂按比例尺切成5 mm ×5 mm的小块，接入制备好固体培养基中，待菌丝长至1/3平皿，加入幼虫液。菌丝生长密集（图4），培养基表层长出气生菌丝（图5）、分生孢子结构（图6）。

图1　不同基质菌丝生长速率（mm/d）

图2　不同pH真菌菌丝直径（mm/d）

图3　不同T对菌丝生长率的影响

图4　06WSA培养基深层菌丝 -40×

图5　气生菌丝 -40×

图6　分生孢子-100×

线虫幼虫可以刺激捕食线虫性真菌产生捕食性结构（图7）。线虫幼虫一旦接触到它们，就会被套住而遭捕获（图8），经1～2 h 后死亡。

图7　菌环将线虫捕食 -200×

图8　菌网将幼虫捕食 -200×

在拟定的试验条件下，捕食线虫性真菌长势较好，形成气生菌丝（图10），分生孢子（图11）。

6　讨论

（1）本试验对捕食线虫性真菌最适培养基组成进行了优化，研究结果显示：菌在06 麸皮粉固体培养基生长较好。这是实验的一大创新之处。在正交试验时得出最适pH值为7.0，但最佳pH值范围6.5～8.0与已报道的研究结果有一定出入。内蒙古农业大学杨晓野等人曾系统的研究过少孢节丛孢菌的生长特性，其生长所需最佳pH值为6.0～6.2。分析其原因可能是由于菌株来源不同或经过几代过程已发生变异的结果，这有待于进一步研究验证。

（2）首次试用麸皮培养基进行实验。做成麸皮琼脂培养基培养捕食线虫性真菌有其独特优势，较马铃薯琼脂培养基（PDA）具有更高的透明度，易于观察；较之玉米粉琼脂培养基（CMA），真菌生长速度快，缩短菌株培养时间，且也容易形成孢子。