董坤+常静+祖可佳+王欣欣+刘晖+冯骥良+吕福东

[摘要] 目的 探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）及ki67在不同分化程度的肝细胞癌（HCC）中的表达强度，分析不同分化程度的肝细胞癌组织中GPC3的表达强度与ki67之间的关系。 方法 搜集2010年7月～2014年7月首都医科大学附属北京佑安医院病理科90例HCC部分肝切除标本。采用免疫组化SP法检测HCC中GPC3及ki67的表达情况，比较不同分化程度的HCC中GPC3及ki67表达的强度，分析不同分化程度HCC中GPC3表达情况与ki67之间的关系。 结果 低分化HCC中GPC3的阳性率（90.00%）明显高于中分化（83.33%）和高分化（50.00%），且中分化明显高于高分化，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；GPC3中-强着色度（+++～++++）在低分化HCC中阳性率（66.67%）高于中分化（23.33%）及高分化中（6.67%），且中分化明显高于高分化，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；低分化HCC中ki67的表达高于中分化和高分化，且中分化高于高分化，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；不同分化HCC中GPC3的表达与ki67呈正相关（r = 0.551，P = 0.000）。 结论 GPC3、ki67的表达强度与HCC的分化有关；GPC3的表达与肝细胞癌的ki67表达呈正相关。

[关键词] 肝细胞癌；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；ki67；分化程度

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）10（b）-0023-05

Analysis of expression of Glypican-3 and ki67 in different grade of hepatocellular carcinoma

DONG Kun CHANG Jing ZU Kejia WANG Xinxin LIU Hui FENG Jiliang LU Fudong

Department of Pathology， Beijing You'an Hospital， Capital Medical University， Beijing 100069， China

[Abstract] Objective To investigate the expression intensity of Glypican-3 （GPC3） and ki67 in different grade hepatocellular carcinoma （HCC）， and analyze the relationship between the expression of GPC3 and ki67 in different grade HCC. Methods From July 2010 to July 2014， in Department of Pathology， Beijing You'an Hospital， Capital Medical University， 90 samples of HCC hepatectomies were selected. GPC3 and ki67 were detected by immunohistochemistry SP method， the expression intensity of GPC3 and ki67 in different grade HCC were compared， the correlation of GPC3 and ki67 in different grade HCC was analyzed. Results The positive expression rate of poorly differentiated HCC （90.00%） was significantly higher than that of intermediate differentiated HCC （83.33%） and well differentiated HCC （50.00%）， and this of intermediate differentiated HCC was significantly higher than that of well differentiated HCC， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Middle to strong staining intensity positive expression rate of GPC3 in poorly differentiated HCC （66.67%） was higher than that of intermediate differentiated HCC （23.33%） and well differentiated HCC （6.67%）， that of intermediate differentiated HCC was significantly higher than that of well differentiated HCC， the differences were statistically significant （P < 0.01）. The ki67 exeression of poorly differentiated HCC was higher than that of intermediate differentiated HCC and well differentiated HCC， and this of intermediate differentiated HCC was significantly higher than that of well differentiated HCC， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Strength of the expression of GPC3 had positive correlation with the expression of ki67 （r = 0.551， P = 0.000）. Conclusion The expression of GPC3 and ki67 have correlation with the differentiation of HCC. GPC3 has positive correlation with the expression of ki67.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Glypican-3； Ki67； Differentiated grade

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一，其发病率在男性癌症中排名第5位（523 000例/年，所有癌症中占7.9%），在女性癌症中排名第7位（226 000例/年，所有癌症中占6.5%）[1]。临床初筛HCC首选肝脏超声及血清甲胎蛋白（AFP）检测，有肝硬化的患者血清AFP>200 ng/mL时强烈提示HCC可能，但并不是所有HCC患者的AFP水平都会升高，而且AFP升高并不单纯出现在HCC中[2]。最近的研究发现，无论血清中还是组织中AFP的敏感性及特异性均不高[3]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）是近年来比较热门的一种用于肝细胞癌诊断的标志物，因其敏感性好，特异性高，被认为可能是一种新型癌胚因子[4]。GPC3在胚胎肝脏中表达丰富，但是在成人正常肝脏中无表达[5]。有研究发现GPC3在HCC中表达的敏感性为68%～72%，特异性为92%[1]。但是GPC3在不同分化程度的HCC中敏感性差异的研究较少。ki67作为肿瘤细胞增殖活性的标志物，常用于即时反映肿瘤增殖细胞的数量，判断肿瘤的恶性程度及预后[6]。本研究的目的是通过对不同分化程度的肝细胞癌组织中GPC3和ki67表达的情况进行分析，研究GPC3在不同分化程度的HCC中表达的强度，同时研究不同分化程度的HCC中GPC3和ki67的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

收集2010年7月～2014年7月首都医科大学附属北京佑安医院病理科的HCC部分肝切除标本共90例，其中高分化30例，中分化30例，低分化30例。

1.2 材料和试剂

GPC3， ki67抗体及二抗PV6000均购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

所有标本先经过10%的甲醛固定后，取材，按脱水、透明、浸蜡、包埋程序处理，4 μm连续切片，之后进行HE染色，肝癌病理诊断经2名副主任以上医师复诊。HCC的镜下分级采用WHO推荐HCC分级标准[7]。

1.3.1 染色方法 采用EnVision两步法，上述切片经烤片、脱蜡，梯度乙醇由高至低入水，入3%过氧化氢5 min，PBS缓冲液浸透3次，每次5 min，放入pH 6.0柠檬酸缓冲液中高温高压修复：高压锅喷气后，加热2 min，变中火2 min，关火后焖10 min，放入冷水中冷却至37℃，之后入PBS缓冲液洗3次，加GPC3一抗（鼠抗人单克隆抗体），4℃冰箱过夜，PBS缓冲液浸3次，每次5 min，加二抗PV6000（通用型抗体）37℃10 min，PBS缓冲液浸3次，DAB显色，PBS液终止染色，甲醛逐级由低至高浓度脱水至入二甲苯，封片。ki67染色步骤同GPC3。

1.3.2 判断方法 ki67染色位于细胞核，免疫组化诊断标准[8]：细胞膜或细胞浆内出现淡黄色、棕黄色或棕褐色为阳性；每张切片随机选取5个高倍视野（400×），每个视野数100个细胞， 按阳性细胞所占百分比评分：诊断分级为≤5%，>5%～30%，>30%～50%，>50%。GPC3染色位于胞浆及细胞膜。免疫组化诊断标准[8]：细胞膜或细胞浆内出现淡黄色、棕黄色或棕褐色为阳性；每张切片随机选取5个高倍视野（400×），每个视野数100个细胞， 按阳性细胞所占百分比评分：“-”：<5%的肿瘤细胞着色；“1”：5%～25%的肿瘤细胞着色；“2”：>25%～50%的肿瘤细胞着色；“3”：>50%～75%的肿瘤细胞着色；“4”：>75%的肿瘤细胞着色；其次染色强度评分：不着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。最后将染色强度与阳性细胞所占百分比计分乘积作为每例染色的综合评分，0分为（-），1～2分为（+），3～5分为（++），6～9分为（+++），≥10分为（++++）。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 90例患者一般资料情况

90例患者，年龄38～84岁，平均（53.7±0.1）岁；男68例，女22例；HBsAg阳性66例，阴性24例；肿瘤直径≤5 cm者46例，>5 cm者44例；肿瘤单发者74例，多发者16例；伴肿瘤坏死者30例，无肿瘤坏死者60例；伴脉管内癌栓者18例，无脉管内癌栓者72例；有肝硬化背景者56例，无肝硬化背景者34例。GPC3的表达强度与患者的年龄、性别、HBsAg阳性与否、肿瘤直径、肿瘤数目、肿瘤坏死、脉管内癌栓及肝硬化无关（P > 0.05）。见表1。

2.2 不同分化程度的HCC HE组织染色

高分化HCC显示细胞轻度异型，肝板结构紊乱，可见肿瘤细胞假腺样排列（图1A，封三）；中分化HCC显示肿瘤细胞中度异型，核浆比增加，肿瘤细胞呈假腺样或细梁状排列（图1B，封三）；低分化HCC显示肿瘤细胞异型性明显，细胞核大，核膜不规则，可见核仁，肿瘤细胞呈团巢状或实性片状排列（图1C，封三）。

2.3 GPC3在高、中、低分化HCC组织中的表达

GPC3在HCC中的着色在细胞膜和细胞质，大部分肝细胞癌是混合着色，HCC分化越低，GPC3着色越强（图2，封三）。不同分化的HCC组织中GPC3表达的强度及阳性率性况具体见表2。高分化的HCC中GPC3阳性率为50.00%，其中“+～++”阳性率为43.33%，“+++～++++”阳性率为6.67%；中分化的HCC中阳性率均为83.33%，其中“+～++”阳性率为60.00%， “+++～+++++”阳性率为23.33%；低分化的HCC中阳性率为90.00%，其中“+～++”阳性率为23.30%，“+++～++++”阳性率为66.67%。统计结果显示：GPC3在低分化的HCC中的阳性率明显高于中分化及高分化，并且中分化高于高分化，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。低分化组中GPC3的强阳性（+++～++++）率明显高于中分化及高分化，并且中分化明显高于高分化，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。说明GPC3的表达与HCC的分化程度有关。