谢玲林

[摘要] 目的 探讨SIRT6基因沉默对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 构建肝癌细胞系，转染SIRT6，检测SIRT6 mRNA及蛋白质的表达水平；将表达shSIRT6的慢病毒感染Huh-7细胞，培养后检测SIRT6 mRNA、蛋白质表达水平及凋亡情况。结果 成功构建了沉默SIRT6基因的Huh-7稳定细胞系，在Huh-7细胞中，mRNA表达的抑制率达81.25%，其SIRT6蛋白质水平亦受到抑制；Huh-7细胞的凋亡比例为（16.52±2.08）%。 结论 SIRT6基因沉默可诱导人肝癌细胞凋亡，进而抑制其增殖。

[关键词] 肝细胞癌；SIRT6；增殖；凋亡

[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）01（c）-0054-03

Effect of SIRT6 Gene Silencing on the Proliferation and Apoptosis of Liver Cancer Cells

XIE Ling-lin

Microbiology Teaching and Research Room， Sichuan Nursing Vocational College， Chengdu， Sichuan Province， 610100 China

[Abstract] Objective To discuss the effect of SIRT6 gene silencing on the proliferation？and？apoptosis of liver cancer cells. Methods The SMMC-7721 was constructed and transfected with SIRT6， and SIRT6 mRNA and protein expression levels were tested， and SIRT6 mRNA， protein expression level and apoptosis were tested after culturing the slow-virus infection Huh-7 cells expressing shSIRT6. Results Huh-7 stable cell line of the silencing SIRT6 gene was successfully constructed， in the Huh-7 cells， the inhabitation rate of mRNA expression reached 81.25%， and the SIRT6 protein level was also inhabited， and the apoptosis ratio of Huh-7 cells reached （16.52±2.08）%. Conclusion SIRT6 gene silencing can induce the apoptosis of human hepatoma cells thus inhabiting the proliferation.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； SIRT6； Proliferation；Apoptosis

肝细胞癌作为临床上常见的恶性肿瘤，其患病率及病死率一直居高不下，手术是常用的治疗手段，但效果常不尽如人意。探索肝细胞癌的发生发展的内在机制，寻求有效抑制癌细胞增生的新疗法一直是临床研究的重要课题。Sirtuins是存在于哺乳动物基因中的酵母沉默信息调节因子的同源基因，其中，沉默信息调节因子6（silent information regulator 6，SIRT6）具有抗癌作用，而当SIRT6缺失时，细胞则会出现组蛋白H3第56位赖氨酸（histone H3 on lysine 56，H3K56）高度乙酰化，而这是与肿瘤息息相关的一类染色质修饰。此外SIRT6对基因组的稳定性、炎性反应等都有调节作用，这也是其发挥抑癌作用的一个重要方面[1]。该研究以2015年1月—2016年1月来四川护理职业学院附属医院就诊的88例肝癌患者的细胞系为研究对象，旨在探讨SIRT6对肝癌细胞增殖和凋亡的影响，并分析其内在机制，以期为肝癌的临床治疗提供新的思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

88例人肝癌细胞系SK-Hep-1、PLC/PRF/5、HepG2、Huh-7均来自2015年1月—2016年1月来四川护理职业学院附属医院就诊的肝癌患者；永生化肝细胞系MIHA购自上海冠导生物工程有限公司；pCMV6-XL5和pCMV6-XL5-XIAP质粒购自Cell Biolabs公司；shSIRT6慢病毒购自GeneChem公司；SIRT6抗体购自Sigma公司；羊抗鼠IgG-HRP和GAPDH抗体购自上海市雅吉生物科技有限公司；羊抗兔IgG-HRP购自北京博尔西科技有限公司；质粒转染试剂购自Roche公司；siRNA转染试剂Lipofectamine 2000购自上海联硕生物科技有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南昌乐悠生物科技有限公司；培养基购自Gibco公司；RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司。

1.2 细胞培养

在5%CO2，37℃的恒温箱中分别对SK-Hep-1、PLC/PRF/5、HepG2、Huh-7 4個细胞系进行培养，并按说明书进行质粒转染及siRNA转染。

1.3 Western blot

收集细胞，洗涤后加入裂解液，离心取上清液，电泳分离蛋白质，转膜后用TBST洗膜，加入包被液，平稳摇动，室温2hr，继续洗膜，加入一抗，4℃放置12hr以上，弃一抗，TBST洗膜，二抗室温2hr，TBST洗膜，加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。阴性对照以β-actin作为内参，其余步骤与实验组相同。

1.4 RT-PCR检测

裂解细胞提取RNA，逆转录为cDNA，利用试剂盒进行RT-PCR，以β-actin为内参，每组实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

SK-Hep-1和Huh-7细胞转染72 h后，洗涤并离心，加入195 μL Annexin-V结合液重悬细胞、6μL Annexin-V、4 μL PI，室温避光孵育20 min，立即进行流式细胞术进行检测。

1.6 统计方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析数据，两组间比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT6在肝癌细胞系中的表达

经RT-PCR和Western blot结果显示，SIRT6在4个肝癌细胞系中的mRNA和蛋白质水平较永生化肝细胞系MIHA明显升高，见图1、2。

2.2 慢病毒介导的shRNA对SIRT6的抑制作用

将表达shSIRT6的慢病毒感染Huh-7细胞，构建SIRT6-shRNA-Huh-7稳定细胞系，并采用RT-PCR和Western blot检测SIRT6 mRNA及蛋白质水平。结果表明，在Huh-7细胞中，mRNA表达的抑制率达81.25%；应用Western blot检测Huh-7细胞中SIRT6蛋白质水平，结果显示，其SIRT6蛋白质水平亦受到抑制。

2.3 SIRT6基因沉默可诱导人肝癌细胞凋亡

对感染慢病毒后的Huh-7细胞进行流式细胞术检测。结果显示，Huh-7细胞的凋亡比例为（16.52±2.08）%，提示SIRT6基因沉默可诱导人肝癌细胞凋亡。

3 讨论

随着分子生物学的发展，基因在临床中的应用及潜在价值越来越受到医务工作者的重视[2]。SIRT6是Sirtuin家族的重要成员，最早在酵母等低等生物中发现，随后陆续在高等生物的基因中发现其同源序列。哺乳动物的Sirtuin家族包括7个成员，其中SIRT6在抗衰老及抗癌方面有着重要作用[3]。葡萄糖代谢在肿瘤细胞的生长、增殖中占据重要地位，SIRT6可通过调控胰岛素的信号转导来干预葡萄糖的代谢，进而影响肿瘤细胞的增殖和凋亡[4]。除此之外，SIRT6还可参与基因的损伤修复，在维护正常基因序列的同时，对异变的肿瘤基因起到抑制、杀灭的作用[5]。

关于SIRT6在抗癌中的作用，既往有多位学者做了深入研究。该研究成功构建了沉默SIRT6基因的Huh-7稳定细胞系，在Huh-7细胞中，mRNA表达的抑制率达81.25%，其SIRT6蛋白质水平亦受到抑制；Huh-7细胞的凋亡比例为（16.52±2.08）%。提示SIRT6基因沉默对于肝癌细胞的凋亡有促进作用，这与既往相关学者的研究结果相一致。周洪钟等[6]将表达shSIRT6-1、shSIRT6-2的慢病毒分别感染SK-Hep-1和Huh-7细胞，结果显示，SK-Hep-1细胞中shSIRT6-1和shSIRT6-2组的细胞凋亡比例分别为（20.5±2.64）%和（18.4±2.1）%；Huh-7细胞中shSIRT6-1和shSIRT6-2組的细胞凋亡比例分别为（17.4±2）%和（21.93±2.45）%，提示SIRT6基因沉默可诱导人肝癌细胞凋亡。SIRT6可通过p53、p73和ATM信号通路及影响ADP-核糖基转移酶活性促进肿瘤细胞的凋亡。但亦有学者提出不同观点，刘妙娜等[7]的研究证实，SIRT6在HepG2肝癌细胞株过度表达具有较为明显的抗肿瘤作用，该作用在诱导细胞凋亡的基础上，抑制ERK1/2信号通路。同时，SIRT6过度表达能够降低HepG2肝癌细胞ROS水平[8-9]。因而在关于SIRT6的具体抗癌机制及临床应用方面还需进一步探索。

4 结语

SIRT6基因沉默在促进肝癌细胞凋亡，抑制其增殖方面效果显著。但是，其具体的作用机制尚未研究透彻，操作手段目前发展尚不成熟，有待于进一步深入研究。此外，关于SIRT6在肿瘤治疗中的具体作用尚有争议，其双重作用可能有组织、因子分布乃至肿瘤分型及发展阶段等息息相关，这些都需要科研人员及临床工作者的进一步探索。

[参考文献]

[1] 邢荣春，郑军.肝细胞癌基因靶向治疗新进展[J].实用肿瘤杂志，2016，31（3）：285-288.

[2] 马澜婧，马玉帛，张松，等.SIRT6与肿瘤关系的研究进展[J].临床肿瘤学杂志，2015，20（8）：745-749.

[3] 张智高.SIRT6在原发性肝癌中的表达变化及其抑瘤机制的研究[D].济南：山东大学，2014.

[4] 肖元元，王倩倩，毛月芹，等.Exendin-4对游离脂肪酸诱导肝细胞sirt6表达及其对糖异生作用的影响[J].医学研究杂志，2015，44（1）：39-43.

[5] 周洪钟，陶娜娜，陈祥，等.SIRT6基因沉默对裸鼠异位移植人肝癌细胞增殖和凋亡的影响[J].中国细胞生物学学报，2016，38（7）：821-828.

[6] 周洪钟，陶娜娜，陈祥，等.SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制研究[J].中国细胞生物学学报，2016，38（4）：389-396.

[7] 刘妙娜，刘琢冰，郑娟，等.SIRT6在原发性肝癌中的表达变化与抑瘤机制分析[J].北方药学，2016，13（8）：108-108，109.

[8] 陈明.肝细胞癌的诊治概述[J].中外医疗，2013，32（21）：181-182

[9] 秦勇. 细胞内ROS水平改变对细胞活性及相关信号传导途径的影响[D].杭州：浙江大学，2012.