张飞飞　石牡丹　尚广东

摘要 [目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌E. coli BL21（DE3）的转化效率。[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能。[结果]敲除了编码降解外源DNA的I型限制性内切酶的hsdR基因，获得了高转化效率以及其他功能与BL21（DE3）仍保持一致的LS1928菌株。[结论]获得的LS1928菌株可能会作为获得催化用酶的关键材料，进而在蛋白质工程等研究领域有着重要的作用。

关键词 重组工程；基因敲除；双链断裂修复；大肠杆菌BL21（DE3）

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-029-03

Abstract [Objective] The aim was to improve the conversion efficiency of the most commonly used heterologous protein expression host strain. [Method] Type I restriction endonuclease capable of degrading exogenous DNA coding gene hsdR was knocked out via plasmidbased recombineering system as well as its inherent double strand break repair（DSBR） function. [Result]The obtained strain LS1928 was still consistent with E. coli BL21（DE3） in every aspect except higher conversion efficiency.[Conclusion] The newly developed strain has the potential to be used as key material to obtain catalytic enzyme and hence plays an important role in protein engineering.

Key words Recombineering； Gene knock out； DSBR； E. coli BL21（DE3）

酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业生物技术的基础。野生型的酶常常难以具有人们所期望的最佳活性。高催化活性以及高催化专一性酶的获得常常依赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的菌株是获得高覆盖率蛋白突变体库的基础之一。突变体库也是研究基因或蛋白结构和功能的关键手段。

常规的得到蛋白突变体的试验步骤是将通过特定方法（如DNA shuffling[1]和易错PCR[2]）所获得的突变体基因库以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的载体在T4连接酶的作用下相连，连接液转化至克隆宿主菌大肠杆菌（Escherichia coli）如DH10B或JM109，培养所得抗性菌株，从中提取质粒后，再转化至异源蛋白表达宿主菌。其中E.coli BL21（DE3）是最为常用的宿主菌，其他菌株一般为此菌株的衍生菌株。采用提取质粒再转化BL21（DE3）的两步法而非直接转化BL21（DE3）的原因在于后者的转化效率较低，一般低10倍以上。……