王永娟　王岑　朱善元　左伟勇

摘要：无菌采取鹅外周血并进行抗凝处理，以全血提取法、细胞分离直接提取法、细胞分离培养提取法及细胞分离诱导提取法分别提取外周血中淋巴细胞的总RNA；紫外分光光度计检测总RNA的纯度和得率；以总RNA为模板通过RT-PCR法扩增鹅α-干扰素（GoIFN-α）基因，并构建重组质粒pGEMT-α，通过比较GOIFN-α序列确定各种提取方法的可行性。结果显示，4种方法提取的RNA纯度高，均可作为模扳扩增出目的基因，满足后续的分子生物学研究；其中以细胞分离直接提取法制备的RNA产量最多，此结论为外周血淋巴细胞总RNA的提取提供了一种更快捷的方法。

关键词：外周血；淋巴细胞；RNA提取；RT-PCR；方法比较；鹅；干扰素

中图分类号：S858.33 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0204-02

干扰素是真核细胞对各种刺激作出反应而自然形成的一组复杂且具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。刺激产生干扰素的外源因素主要有病毒和其他种类的干扰素诱导剂，如植物血凝素（PHA）、刀豆素（ConA）。在外源因素刺激下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，从而获得丰富的含有丝分裂且生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，提取总RNA并反转录，即可得到1个表达细胞因子的cDNA库。多个报道显示，为获取目的基因，一般在外源因素刺激后再提取外周血淋巴细胞总RNA，本研究尝试采用多种方法制备总RNA并扩增目的基因，以探索一种最为快捷简便的外周血淋巴细胞总RNA提取方法，为其他细胞因子的分离奠定基础。

1.材料和方法

1.1试验材料

成年扬州白鹅购自扬州瑞农科技有限公司；刀豆球蛋白（conA）购自Sigma公司；Trizol购自Invitrogen公司；禽淋巴细胞分离液购白天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase、RNaseInhibitor、TaqDNA聚合酶、1kbDNALadderr、PrestainedProtein分子量marker、pGEM-TEasyVectorSystem、限制性内切酶、质粒提取试剂盒购自美国Promega公司；胶回收试剂盒、细胞培养液、细胞消化液、DH5cα大肠杆菌感受态细胞购自康为世纪生物科技有限公司。

1.2引物设计与合成

根据已发表的GoWN-α基因序列（登录号：HQll5583）设计1对引物，拟扩增的全长序列为576bp。引物F1：5'-ATGCCTGGGCCATCAGCCCCAC-3'和R1：5'一TTAGCGCAT—GGCGCGGGTGAGG-3'由上海Invitrogen公司合成。

1.3总RNA提取

1.3.1细胞分离诱导提取总RNA使用无菌注射器采取鹅翼静脉血5mL，3.8%枸橼酸钠抗凝。按淋巴细胞分离液说明书分离淋巴细胞，加入含10%小牛血清的RPMI-1640细胞培养液并吹匀，计数后稀释至2×10⁶个/mL。用终浓度64mg/LConA刺激诱导，于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后，收集细胞并按Trizol试剂说明书提取总RNA，通过紫外分光光度仪测其纯度和浓度。

1.3.2细胞分离培养提取总RNA使用无菌注射器采取鹅翅静脉血5mL，3.8%枸橼酸钠抗凝。按淋巴细胞分离液说明书分离淋巴细胞，后将其重悬于含10%小牛血清的RPMI一1640细胞培养液中，计数后稀释至2×10⁶。个/mL，于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后，按Trizol说明书提取总RNA，通过紫外分光光度仪测其纯度和浓度。

1.3.3细胞分离直接提取总RNA使用无菌注射器采取鹅翼静脉血5mL，3.8%枸橼酸钠抗凝。按淋巴细胞分离液说明书分离淋巴细胞，用PBS重新悬浮，反复洗涤2～3次后按Trizol说明书提取总RNA，通过紫外分光光度仪测其纯度和浓度。

1.3.4全血提取总RNA使用无菌注射器采取鹅翼静脉血5mL，3.8%枸橼酸钠抗凝。按Trizol说明书直接提取总RNA，通过紫外分光光度仪测其纯度和浓度。

1.4GoIFN-α基因的RT-PCR扩增

GOIFN-α基因的反转录（RT）：取上述4种RNA悬浮液各5μL，参照反转录酶说明书，均选用特异性引物R1分别合成cDNA第1链，RT产物各自标记岳于20℃保存。

GolFN-α基因的PCR扩增：取上述4种RT产物各2μL为cDNA模板，分别加入MixTaqDNA聚合酶25μL，上、下游引物（F1、R1）各1μL，超纯水补足至各反应体系均50μL，混匀后参照下列反应程序进行PCR扩增。反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；72℃终延伸10min。PCR产物各取5μL经1.0%琼脂糖凝皎电泳初步鉴定片段大小。

1.5Gol-α基因的克隆与鉴定

将上述4种经凝皎电泳鉴定后的PCR产物用皎回收试剂盒纯化回收，并分别与pGEMT-easy载体进行连接，按照常规方法转化DH5c～感受态细胞后进行蓝白斑试验，提取重组质粒并作酶切鉴定。将阳性GoLFN-α全基因重组质粒送至上海立菲生物技术公司测序。

2.结果与分析

2.1总RNA纯度与浓度测定

紫外分光光度仪分别测定4种不同方法提取的总RNA纯度和浓度，结果见表1，其中D260nm/D280nm值反映总RNA的纯度。

2.2GoLFN-α全基因的扩增

对上述4种方法所得的扬州鹅外周血总RNA，采用体积及反应条件完全相同的反应组分进行反转录。之后在相同条件下进行全长GolFN-α基因的PCR扩增。扩增产物经1.2%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，均获得了符合预期大小的约576bp的条带（图1）。endprint

2.3GoLFN-α全基因克隆与鉴定

将各PCR产物克隆至pGEM-T载体，分别用限制性内切酶SalI或EcoRI对重组质粒进行酶切鉴定，酶切产物经

1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2（以细胞分离直接提取法所得GolFN-α基因重组为例），均出现预期大小的DNA条带，鉴定正确的重组质粒命名为pGEMT-α。

2.4GolFN-α基因序列测定

将各种方法所对应的重组质粒pGEMT-α>送至上海立菲生物技术公司测序，结果见表2-4种方法制备的GoLFN-α序列同源性为100.0%，与参考序列的同源性为99.7%。

3.结论与讨论

本研究通过4种方法制备鹅外周血淋巴细胞总RNA并扩增目的基因GolFN-α，结果显示，各种方法所制备的总RNA均可扩增出预期的目的基因，其中以“细胞分离直接提取法”所得总RNA浓度最高，同等条件下所得目的基因产量也最多。此结果提示我们：从外周血淋巴细胞中分离细胞因子，可以避开以往的细胞分离诱导提取法，改用无需诱导剂的细胞分离直接提取法，既高效又快捷，且能满足后期的分子生物学研究。另外，全血提取法在不分离淋巴细胞的情况下直接提取，同样获得了目的基因，因此在对目的基因无产量要求的情况下全血提取法也是很好的选择。

本研究中的全血提取法、细胞分离培养提取法及细胞分离直接提取法均未涉及到淋巴细胞的诱导，但却成功获得了目的基因，究其原因可能是所采鹅已受到外来病毒的感染，外周血淋巴细胞已转化为具有分化能力的淋巴母细胞，因此，分离的外周血细胞就算没有刺激也可以达到预期目的。其中细胞分离直接提取法，淋巴细胞已从全血中分离出来却又未经培养，淋巴细胞密度大、活性高，因此同等条件下总RNA和目的基因产量均最高。而全血提取法可能含其他细胞RNA量较多，故出现总RNA产量高、目的基因产量不高的局面。

本研究各种方法获得的GolFN-α基因序列与GenBank中已发表的GolFN-α基因序列（登录号：HQll5583）同源性达99.7%，说明该基因相对保守，证实了禽IFN-α基因序列保守性良好、遗传进化变异缓慢的观点。

综上所述，细胞分离直接提取法可以替代甚至优于之前常用的诱导法以实现畜禽细胞因子的分离扩增；全血提取法操作简单，在对目的基因无产量要求的情况下也可运用。endprint