蒙春蕾　王勇勇　黄敏　蔡爽　孟庆恒　孙建华

摘要：海洋来源的枝顶孢霉（Acremnium，BHO531）是一株以松材线虫为靶标筛选出的杀线虫真菌。氮源的化合态和种类对该菌株的生长以及代谢产物的活性有显著影响。研究结果显示，不同氮源对菌体生长量的影响差异显著，有机氮优于无机氮；代谢物的杀线虫活性则表现为无机氮优于有机氮，其中以NaNO3为氮源的发酵液对松材线虫的杀线率以及NH4cl为氮源的发酵液对根结线虫的杀线率分别高达95.67%和96.60%，均高于有机氮源中最高的蛋白胨。根结线虫对各种无机氮源发酵液的敏感性普遍高于松材线虫。此外，经高温处理的代谢物仍观察到较强的杀线虫活性，显示出良好的热稳定性。

关键词：海洋枝顶孢霉；氮源；杀线活性；松材线虫；根结线虫

中图分类号：Q939.9；5；432.4.5 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0121-03

植物寄生线虫是一类世界性分布的重要植物病原物，其寄生范围广，环境适应性强，几乎每种作物都受到植物线虫的侵害，其危害程度仅次于真菌，已超过细菌、病毒，成为第二大植物病害，防控形势严峻。真菌杀线剂（具杀线活性的代谢产物）是一类环境友好型生防因子，越来越受到广泛重视。已经报道的具有杀线虫活性的真菌种类超过700种，已分离得到的杀线虫活性代谢产物多达230余种。这些杀线虫真菌及其代谢物的研究主要集中在陆生性真菌（包括病原菌和内生真菌），如淡紫拟青霉活菌剂和总状共头霉（Srl8菌）等。海洋来源的枝顶孢霉（Acremnium，BHO531）是一株已被证实具有较好杀线虫作用的海洋真菌。不同于陆生性真菌，该菌在添加海水的培养基中的生长情况和杀线虫活性均优于普通察氏培养基，且其代谢活性物具有含氮化合物属性；因此，探究不同化合态的氮源对该菌在察氏培养基生长及其代谢物杀线虫活性的影响，将有助于活性代谢产物发酵条件的优化，克服海水高盐组分对发酵设备的影响。据此，本试验以松材线虫、黄瓜根结线虫二龄幼虫（.T2）为对象，以杀线虫效果（杀线率）为指标，测定了NaNO3、KNO3NH4NO3、（NH4），SO4、NH4Cl等不同氮源对BH0531菌株生长状况及其活性代谢产物的影响，旨在为进一步优化该菌的发酵条件提供试验依据。

1.材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株海洋枝顶孢霉（Acremnium，BHO531），菌种保藏号CGMCC-5445；灰葡萄孢霉（Batrytisnerea，BC菌），以上菌种由天津师范大学生命科学学院微生物实验室提供。

1.1.2供试线虫松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus），中国农业科学院植物保护研究所提供；黄瓜根结线虫（Meloido-gyneincognita）取白天津市宝坻区黄瓜大棚基地。

1.1.3供试培养基（1）活化培养基：去皮马铃薯200g/L煮汁，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，蒸馏水定容至1000mL；用于活化BH0531菌株。（2）发酵培养基：2g/L氮源，1g/LKH2O4，0.5g/LMgSO40.5g/LKCl，0.01g/LFez（SO4）3·5H2O，20g/L葡萄糖，pH值自然。氮源分别为NaN0，、KNO3、NH4NO4、（NH4）：SO4、NH4C1、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏。（3）大麦仁培养基：10g大麦仁，8mL去离子水，大试管浸泡3～6h，灭菌，用于BC菌培养。

1.2试验方法

1.2.1BH0531菌株的培养将保藏的BHO531菌种接种至活化培养基斜面试管，26qC培养5～7d。

1.2.2灰葡萄孢霉的培养

将灰葡萄孢霉接人大麦仁培养基，21℃生化培养箱内培养7d，用于松材线虫的培养。

1.2.3

松材线虫的培养将松材线虫接种于培养好的BC菌上，25℃下避光培养7d；通过贝尔曼漏斗法收集松材线虫，制备成浓度为10000条/mL的线虫悬液。1.2.4黄瓜根结线虫二龄幼虫（J2）的制将大田取得的黄瓜病根剪成1cm小段；在1%次氯酸钠溶液中漂洗4min，再在匀浆机里搅拌2min；利用100目、300目和500目的网筛冲洗并收集虫卯。再将卯收集到的离心管中，在底部加入40%蔗糖溶液，3500r/min密度梯度离心5min。之后吸取界面溶液过500目网筛，反复冲洗收集卯。将上述收集得到的卯置于已消毒的培养皿中，垫上湿润滤纸，25qC下孵化4d。

1.2.5发酵液的制取活化的BHO531菌株斜面，加入无菌水洗脱孢子，制备浓度为2×10。CFU/mL的孢子悬液，以1%的接种量分别接入不同氮源发酵培养基中，26℃、120r/min培养96h。发酵菌液经离心除菌（6000r/min30min，Eppendorf-5810），再经孔径为O.22um的微孔滤膜过滤，即为发酵滤液，用于活性分析。

1.2.6不同氮源发酵液杀线虫活性检测

将所获发酵液分为灭菌组和未灭菌组，以无菌水为对照，分别以松材线虫和黄瓜根结线虫（J2）为靶标，进行杀线虫活性检测。具体方法如下：取96孔板，每孔加入靶标线虫悬液10μL（约100条），再分别加入100μL不同氮源的发酵液，设3次重复，25℃下培养，3d后体视显微镜下观测线虫死亡情况，按下式统计线虫校正死亡率：

线虫校正死亡率=（处理线虫死亡率一对照线虫死亡率）/（1一对照线虫死亡率）×100%。

应用SPSS12.0软件对结果进行统计分析，并且采用Duncan's新复极差法进行差异显著性分析。

2.结果与分析

2.1不同氮源对BH0531菌体生长的影响

试验结果（图1、表1）表明，不同氮源对BHO531菌丝体的外观和生物量有明显影响。图1结果显示，经不同无机氮源发酵后，发酵液透明，呈淡黄色，菌丝球结构松散，外观不规整（图1-A至E）；而在蛋白胨和酵母膏条件下，菌丝体外观结构紧密，呈均匀球状分布，直径明显大于无机氮源条件（图1-G至H）；牛肉膏中菌丝体则介于二者之间（图l-F）。生物量测定结果进一步证实了不同氮源对该菌的影响存在明显的差异（α=0.05），尤其体现在有机氮源和无机氮源之间（表1）。不同氮源对菌体生长的作用由大到小依次为蛋白胨>酵母膏>牛肉膏>KNO3>NaNO3>（NH4）2SO4>NH4NO3>NH4Cl。

2.2不同氮源发酵液对松材线虫活性的影响

在试验选定的8种氮源中，以NaNO，作为氮源的发酵液表现出了较好的杀线虫活性，杀线率≥90%，达到A级（表1），其次为蛋白胨、NH4C1和KNO3，。值得关注的是除NH4cl外，其余3种氮源的发酵液经灭菌后其代谢产物仍然具有≥60%的杀线活性，表明活性代谢产物具有较好的耐热性。表1的分析结果显示，代谢物的杀线虫活性主要与氮源的种类密切相关，菌体生物量与代谢物杀线虫活性在选定用量范围内未显示出明确的相关性。这一结果提示，选用适当的无机氮源如NaNO+用于发酵，从代谢活性物的角度可以代替海水培养基来获得高活性的代谢产物。

2.3不同氮源发酵液对黄瓜根结线虫（.T2）存活的影响

研究结果表明，BHO531代谢物不仅对松材线虫有确切的杀线活性，对根结线虫也有显示出很强的杀线活性。不同氮源发酵液在灭菌前后，对黄瓜根结线虫幼虫J2的杀线率均较高，除牛肉膏、酵母膏外，其他6种氮源对根结线虫的校正死亡率均大于75%（表2）。以NH4CI为氮源的发酵液对黄瓜根结线虫的杀线率最高，达到96%，与该发酵液对松材线虫的杀线率差异较大。表2结果还显示，灭菌组中各氮源发酵液对黄瓜根结线虫杀线率不仅差异显著，还突出地表现出无机氮源的优势；未灭菌组中有机氮源间杀线率差异极显著（P<0.01），无机氮源发酵液间杀线率差异虽不显著，但其杀线率均在B级（>85%）以上，具有较高的杀线活性。进一步表明选用适当的无机氮源用于BHO531活性代谢物的发酵，可以用来替代海水培养基获得高活性的代谢产物。

3.讨论

海洋来源的枝顶孢霉（Acremnium，BH0531）是一株以松材线虫为靶标筛选出的生防菌，但该菌在海水培养基中显示的生长优势并不适用于规模发酵的设备条件要求。而含氮无机盐是海水中的重要成分，因此，探究其在不含海水的培养条件下的生长要素及其对杀线虫活性代谢物的影响就显得十分必要。研究结果表明，不同氮源，特别是无机氮源对BHO531生长状况的影响较大。有机氮源虽然有利于菌丝体的增加，但其杀线率的优势并未随菌丝体的增加而提高。试验结果表明，以NaNO3和NH4C1 2种不同化合态的无机氮作为氮源时，菌体的生长状况虽然不如有机氮，但所产生的代谢产物对松材线虫与黄瓜线虫分别显示出较高的抑制率，且其活性产物均显示出良好的热稳定性，为今后进一步优化发酵条件、完全取代海水培养基提供了试验依据。

研究还发现，BHO531代谢物对松材线虫和根结线虫的杀线效果存在一定的差异。根结线虫对于以察氏培养基为基础的不同氮源的发酵产物的敏感性明显高于松材线虫。有报道显示，不同离子对南方根结线虫的排斥性为K+、NH+和N03>Cl，其中NH+和NO+组成的化合物NH4NO3对南方根结线虫有强烈的排斥力，且随着浓度升高而上升。所不同的是，各种含氮无机盐在BH0531的培养过程中作为氮源会被菌体转化利用，而且用量仅为2g/L，低于察氏培养基的标准用量（3g/L），因此其高效的杀线虫活性主要取决于代谢活性物的生成。至于其活性代谢物杀线虫的机理还有待深入研究。