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棘孢木霉对水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌生物防治的研究

2015-10-20陈立华金秋牛明张营邵孝侯翟亚明

江苏农业科学 2015年5期
关键词:菌核生物防治

陈立华 金秋 牛明 张营 邵孝侯 翟亚明

摘要:为了检测棘孢木霉T12对立枯丝核菌的生防效果,测定了T12对立枯丝核菌RS02菌株竞争性抑制作用,T12挥发性代谢物对RSO2菌核萌发和菌丝生长的影响,T12的发酵液对tlS02菌核萌发、菌丝干质量和侵染相关酶活力的影响。结果显示,培养4d的T12通过空间竞争对RSO2生长产生抑制,抑制率达78.7%;T12产生的挥发性物质对菌核萌发和菌丝生长抑制率分别为10.3%、12.2%;大于10%浓度T12发酵液对菌核萌发、菌丝干质量均表现出显著或明显的抑制效果,50%浓度发酵液对菌核萌发、菌丝干质量的抑制率分别为65.7%、88.2%;培养5d,10%、30%、50%浓度发酵液处理的tlS02纤维素酶活力分别降低了17.4%、55.0%、76.8%,果胶酶活力分别降低了21.8%、53.9、69.5%。综合试验结果可知,棘孢木霉T12能够显著抑制立枯丝核菌的生长并降低其侵染能力。

关键词:立枯丝核菌;菌核;棘孢木霉;生物防治

中图分类号:S435.111.4+2 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2015)05-0115-03

水稻纹枯病是水稻的重要病害,病原菌立枯丝核菌(Rhi-zoctonia solania Kahn)能够在土壤中存活数年,菌核是其主要的侵染源。水稻秸秆还田为纹枯病的发生提供了大量的病源,同时纹枯病病菌对特效药井冈霉素抗性逐年增加,因此迫切须要寻找新的控制水稻纹枯病的方法。棘孢木霉Trichodermaasperellum12菌株是笔者所在实验室分离的对水稻纹枯病具有生防效果的微生物菌株,由于针对棘孢木霉生防水稻纹枯病的报道较少,因此本研究针对棘孢木霉T.asperellum12菌株对立枯丝核菌生长和侵染能力的影响开展相关研究。

1.材料与方法

1.1供试菌株与试验材料

供试的棘孢木霉Trichodermaasperellum12(T12)菌株从江苏省盐城市的滩涂土壤中分离,通过PDA培养基培养,于4℃保存;水稻纹枯病Rhizoctonia solaniaO2(RS02)菌株由河海大学农业环境研究所提供,通过PDA培养基培养,于4℃保存。水稻品种选用武运粳21号,由江苏中江种业股份有限公司生产。

1.2生防菌株T12菌核和发酵液的制备

将RS02接种到PDA培养基上,于28℃培养14d,用无菌镊子捏取菌核放置在无菌滤纸上保存备用。取在PDA上培养3d的T12菌落边缘菌饼3块,接种到放置200mL液体PDA培养液的500mL三角瓶中,于28qC、120r/rain培养96h。用无菌棉花和O.45um无菌滤器过滤发酵液,将获得的无菌T12发酵液于4℃保藏备用。

1.3生防菌T12对RS02的竞争抑制作用

取在PDA上培养3d的T12、RS02菌落边缘的菌饼(直径0.5cm),同时接种到PDA培养基上对峙培养,菌饼之间的距离2cm;以只接种RS02菌饼的培养皿为对照,于28℃培养。每天拍照,通过Photoshop软件测定菌落形成的不规则图形面积,研究T12对RS02生长的影响。

1.4生防菌T12挥发性物质对RSO2菌核萌发和菌丝生长的影响

在PDA培养基中接种T12菌落边缘的菌饼,分别于28℃培养0、4d。将菌核均匀地接种到水琼脂培养基上,将培养皿倒扣在培养0、4d的T12培养皿上,以未接种T12的空PDA培养基作为对照,培养皿接口处用Parafilm封口膜封口,于28℃培养36h,测定菌核萌发率。

在PDA培养基中接种T12、RS02菌落边缘的菌饼,T12分别于28℃培养0、4d,将T12、RS02的2个培养皿倒扣,培养皿接口处用Parafilm封口膜封口,以没有接种T12的培养皿为对照,于28℃培养5d,测定RS02的菌落直径。

1.5

生防菌T12发酵液对RSO2菌核萌发的影响

用T12无菌发酵液、熔解的无菌水琼脂培养基和无菌水混合成培养基,培养基中水琼脂培养基比例相同,发酵液浓度分别设为0、1%、5%、10%、20%、30%、50%,培养基倒入平皿后均匀地接种RS02菌核,每天测定菌核的萌发率。

1.6生防菌T12发酵液对RSO2菌丝生长的影响

将PDA液体培养基、T12发酵液无菌过滤液和无菌水按照比例混合成培养液,培养液中的PDA比例相同,T12发酵液浓度分别设为0、1%、5%、10%、20%、30%、50%。在250mL三角瓶中放置100mE培养液,接种1块RS02菌饼,于28℃、50r/rain培养5d。用无菌滤纸过滤培养液中形成的菌丝,测定菌丝质量。

1.7生防菌T12发酵液对RS02侵染相关酶活力的影响

培养液按照“1.5”节的方法制备,T12发酵液浓度分别设为0、10%、30%、50%。在培养液中添加0.5%果胶、0.5%羧甲基纤维作为RS02产纤维素酶、果胶酶的培养基。在250mL三角瓶中装100mE液体培养基,每个处理的三角瓶中接种1块RSO2菌饼,于28℃、50r/rain培养6d。用高速离心机离心分离菌丝,测定上清液果胶酶、纤维素酶活力,测定菌丝干质量。

利用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的生成量。以羧甲基纤维素钠为底物,测定纤维素酶活力,酶活力单位u定义:1h产生相当于1umol葡萄糖还原物质所需酶量为1个单位酶活。以果胶为底物测定果胶酶活力,酶活力单位u定义:1h释放出相当于1txmol半乳糖醛酸的还原物质所需要的酶量为1个酶活力单位。

2.结果与分析

2.1生防菌T12对RS02生长的抑制作用

RSO2单独培养以及与T12对峙培养的菌落面积如图1所示。对照处理RS02的菌丝5d即长满平皿,与T12对峙培养的RS02菌落在培养4d基本停止生长;相较于对照处理的菌丝形成面积,对峙培养处理菌丝生长面积减少了78.7%;培养5d时,T12菌株菌丝开始覆盖RSO2菌丝。

2.2生防菌T12挥发性物质对RSO2菌核萌发和菌丝生长的影响

T12挥发性代谢物对RSO2菌核萌发、菌丝生长的影响见表1。T12、RSO2同时接种时,T12代谢的挥发性物质对RSO2的菌核萌发率、菌丝生长速度影响不显著;生长4d的T12菌株代谢物显著抑制菌核孢子萌发、菌丝的生长,抑制率分别为10.3%、12.2%.

2.3生防菌T12发酵液对RSO2菌核萌发、菌丝干质量的影响

由图2可知,5%的T12发酵液对RSO2的菌核萌发几乎没有抑制效果,高于10%浓度的T12发酵液能够显著抑制菌核的萌发,50%浓度的发酵液对菌核萌发抑制率达65.7%。

不同处理对RS02菌丝干质量的影响见图3,可见5%发酵液处理菌丝干质量与对照处理没有明显差异,其他处理菌丝干质量均明显低于对照处理(P<0.05);随着发酵液浓度的增加,菌丝干质量越低;RS02培养5d时,相较于对照处理,50%发酵液处理的菌丝干质量降低了88.2%。

2.4生防菌T12发酵液对RSO2侵染性酶活力的影响

RSO2培养过程中单位菌丝质量对应的酶活力如图4所示,可见各处理培养5d都能够检测到酶活力。结果显示,10%、30%、50%浓度的T12发酵液均能够抑制RS02产酶,单位菌丝质量酶活力明显降低。培养5d时,相较于对照处理,10%、30%、50%浓度发酵液处理的纤维素酶活力分别降低了17.4%、55.O%、76.8%,果胶酶活力分别降低了21.8%、53.9%、69.5%。

3.讨论

试验显示,棘孢木霉能够通过生长竞争减小立枯丝核菌的生存空间,这是实现对立枯丝核菌有效防控的途径之一。木霉属真菌能够代谢数十种具有抗生作用的化学物质,其中部分化学物质是具有挥发_性的小分子,棘孢木霉对培养皿上立枯丝核菌菌核萌发和菌丝生长的抑制作用证明,T12菌株也能够代谢具有抑制立枯丝核菌作用的代谢物。与立枯丝核菌同时接种的棘孢木霉没有表现出对菌核萌发和菌丝生长的抑制,表明T12菌株的代谢物主要是成熟期产生。木霉菌的发酵液含有木霉产生的各种代谢物,试验显示10%以上浓度发酵液均显著地抑制立枯丝核菌菌核的萌发和菌丝的生长,这与木霉属真菌生防效果的报道一致。木霉能够通过竞争、产生拮抗物质等手段抑制病原菌,但是关于木霉代谢物对立枯丝核菌侵染能力的影响报道较少。本研究结果显示,棘孢木霉T12的代谢物能够显著降低立枯丝核菌单位质量菌丝产生的纤维素酶和果胶酶活力,表明棘孢木霉代谢物能够显著降低立枯丝核菌的侵染能力。棘孢木霉抑制立枯丝核菌的繁殖和侵染能力的研究,对于进一步开发防效更佳的生防产品具有十分重要的理论意义。

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