彭环庆　彭志允　谢维宁　张志坚　唐钟祥　林辉文

基于血管内皮细胞损伤模型的丹参酮ⅡA治疗慢性心力衰竭的机制研究

彭环庆彭志允谢维宁张志坚唐钟祥林辉文

目的 研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）对慢性心力衰竭（CHF）患者血清损伤后的血管内皮细胞（VEC）的影响，探讨丹参酮ⅡA治疗CHF的作用机制。方法 利用15%的CHF患者血清损伤正常培养的人脐静脉内皮细胞（CRL-1730），用不同浓度的TanⅡA（10、20、40μg/ml）作用于损伤后的细胞24 h，检测VEC的活性及细胞 DNA 的损伤；并检测细胞培养上清液中VEC损伤标志物循环内皮细胞数（CEC）、血管性假血友病因子（vWF）及血栓调节蛋白（TM）的水平变化。结果 与健康对照组比较，模型组VEC细胞活性下降（P＜0.05），尾部DNA%、彗星长及尾矩均上升（P＜0.05），CEC、vWF及TM水平均上升（P＜0.05）；与模型组比较，20μg/ml和40μg/ml的TanⅡA能增加内皮细胞的活性（P＜0.05）；减轻DNA的损伤（P＜0.01）；3个浓度的TanⅡA均可以减少CEC数（P＜0.05）；20μg/ml和40μg/ ml的TanⅡA可降低 vWF水平（P＜0.05）；40μg/ml的TanⅡA可降低TM水平（P＜0.05）。结论 TanⅡA能通过减轻CHF患者血清对内皮细胞的DNA损伤保护VEC，这可能是TanⅡA治疗CHF的作用机制之一。

丹参酮ⅡA 慢性心力衰竭 血管内皮细胞 DNA损伤

我国成年人心力衰竭患者的患病率为0.9%［1］。研究表明慢性心力衰竭（CHF）患者5年内病死率高达50%［2］。随着对CHF发病机制研究的深入，发现血管内皮细胞（VEC）的损伤在CHF发生发展中起着关键作用。故保护CHF患者的VEC及改善其功能，成为治疗CHF一条新的途径。本研究利用CHF患者血清作用于体外培养的VEC，造成细胞损伤模型，观察丹参酮ⅡA（TanⅡA）对损伤后的VEC细胞活性、DNA损伤和循环内皮细胞数（CEC）、血管性假血友病因子（vWF）及血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）的影响，以此探讨TanⅡA治疗CHF的机制。报道如下。

1　材料与方法

1.1一般资料 2013年10月至2014年4月本院门诊和住院CHF确诊病例40例，其中男21例，女19例；入选患者排除合并急性心功能衰竭及肝肾严重并发症。按心功能级别分为：II级24例、III级16例。本院健康志愿者30例作为对照组。两组均空腹采集前臂静脉血，予2000r/min离心15min，取其上清液置入EP管，水浴箱灭活（灭活要求：56℃，30min），-20℃冻存备用。1.2 仪器与材料 凝胶成像系统及酶标仪680型（Biorad公司），胎牛血清（Hyclone公司），DMEM培养基（Gibco公司），低熔点琼脂糖（LMA）及正常熔点琼脂糖（NMA，Promega公司原装），染色剂SYBR Gold nucleic acid gel stain（Molecule probes 公司），二甲基亚砜（DMSO）及四甲基偶氮唑蓝（MTT）为Sigma公司。1.3 培养基与药物的配制 （1）培养基：CHF组：15%的CHF患者血清+85%的DMEM。健康对照组：15%的健康者血清+85%的DMEM。（2）TanⅡA的配制：取TanⅡA2mg，溶于50μl的DMSO，制成浓度为40μg/μl的母液，其他浓度的TanⅡA取母液配制。1.4 内皮细胞的培养 培养液要求用含10%胎牛血清培养液（pH7.2），培养温度为37℃（5%CO2及饱和湿度条件）。

1.5实验分组 VEC接种后分为5组（A、B、C、D、E组），每组培养8孔细胞；予胎牛血清培养24h后A组加入含15%健康人血清的培养基培养作为健康对照组，B～E组加入含15%CHF患者血清的培养基进行损伤造模；以上条件培养基作用24h后，C～E组分别加入10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的TanⅡA，A、B组分别加入等量的DMEM培养基作对照，培养24h后检测指标。

1.6细胞活性检测（MTT法）TanⅡA作用24h后，各组细胞采用MTT法检测细胞活性（酶标仪上490nm处测定吸光值）。

1.7内皮细胞DNA损伤的检测（单细胞凝胶电泳法） TanⅡA作用24h后的细胞约取3×104个，予2000r/min离心5min，弃上清液，37℃保存，备用；取100μl 1.0% NMA PBS凝胶浇注载玻片，4℃固化（5min）；37℃，取含细胞的0.6% LMA PBS凝胶75μl滴于第1层NMA上，同前固化；固化完成后浸入细胞裂解液4℃，2h；于水平电泳槽，高pH电泳缓冲液中浸泡20min；低温（＜15℃），300mA，25V条件电泳20min；pH7.5、0.4mol/LTris浸洗，5min，共浸洗3次；浸洗完成后予20mg染色剂染色15min，P.A.L.M系统（Axiovert200）进行拍照，结果采用casp-1.2分析软件分析，每组分析100个细胞，取三个主要指标（尾部DNA%、彗星长、尾矩）。

1.8内皮细胞损伤标志物的检测 CEC检测：将3ml培养上清液用等量生理盐水稀释，加至密度为1.050的Percoll 液2ml中，1500r/min 离心 20min；取Percoll界面以上液体作为上层以及 Percoll 层液体1ml作为中层；取中层震荡后细胞悬液少许，滴入血细胞计数池中，对全部9个大格中的内皮细胞数计数，同一标本计数 4 次后取平均值。vWF、TM的水平检测：vWF、TM的水平按照酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒说明书进行操作。

1.9统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。数据结果采用（x±s）表示，多组间比较采用随机对照单因素析因方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组内皮细胞的吸光度（OD值） 见表1。

表1　各组内皮细胞的OD值（x±s）

2.2内皮细胞DNA损伤指标结果 见表2。

表2　各组细胞DNA损伤指标的结果（x±s）

2.3内皮细胞损伤标志物检测结果 见表3。

表3　各组内皮细胞损伤标志物的变化（x±s）

3　讨论

VEC的损伤在CHF的发展过程中起着关键的作用。CHF时大量自由基和炎症细胞因子的释放，造成机体内环境稳态的破坏，进而使VEC这一靶器官损伤和功能紊乱［3］。VEC损伤之后出现功能的紊乱将会促进CHF的发展，两者互为因果，形成恶性循环。因此要阻止和打断这种循环，保护VEC及改善其功能是关键的一环。如周鹏［4］的研究表明，前列地尔可改善CHF患者的心功能，同时可降低VEC损伤标志物vWF的水平。

CHF患者VEC受损时，反映VEC损伤的相关指标将发生明显改变，且与心功能分级呈一定的相关性。目前常用的VEC损伤指标有CEC［5］、vWF［6］及TM［7］，均能反映VEC的损伤。本研究发现，当VEC的功能因为损伤而发生改变时，作为构成细胞的基本物质DNA也存在损伤，单细胞凝胶电泳技术（SCGE）被广泛应用于DNA损伤的检测。在一定条件下，DNA迁移距离（彗星尾长）和DNA含量（荧光强度）分布与DNA损伤程度呈线性相关，因此，尾矩（尾部DNA的含量与尾长的乘积）被作为SCGE定量分析的主要依据［8］。本研究表明，CHF患者血清作用于体外培养的VEC导致细胞的损伤，表现为模型组细胞活性明显降低，细胞损伤标志物水平上升，并且VEC细胞DNA损伤明显。与体内实验研究结果一致［9，10］。CHF损伤后的VEC经不同剂量的TanⅡA干预后，其损伤得到修复，具体表现为VEC损伤标志物水平的下降、细胞DNA损伤指标的降低及细胞活性提高，并且呈一定的剂量依赖关系。表明TanⅡA对CHF患者VEC损伤具有保护作用。

TanⅡA 是“活血化瘀”中药丹参的脂溶性有效单体，具有抗缺血、缺氧，改善微循环，抗血栓形成等作用。TanⅡA 在临床上治疗 CHF 取得较好的疗效，能够改善患者的心功能［11］，增加CHF患者的心输出量，其机制可能与TanⅡA降低血浆vWF和升高6-酮-前列腺素F1α的水平，改善血管内皮功能的作用有关［12］。以往研究TanⅡA保护CHF患者VEC的机制主要是集中在TanⅡA对其分泌功能的影响上。本研究亦表明，TanⅡA处理后的VEC其损伤标志物的CEC、vWF及TM的水平下降，同时观察到，当VEC因各种因素受到损伤，功能发生变化时，内皮细胞DNA同样存在损伤，表现为细胞尾部DNA含量、彗星长及尾矩的增加，而通过TanⅡA干预之后，上述指标有明显的下降，表明TanⅡA对VEC的DNA损伤有保护作用，这可能是TanⅡA治疗CHF的机制之一，值得进一步研究。

1 顾东风，黄广勇，吴锡桂，等.中国心力衰竭流行病学调查及其患病率中国心血管健康多中心合作研究（专题报告）.中华心血管病杂志，2003， 31（1）：3～6.

2 Yancy CW，Jessup M，Bozkurt B，et al. 2013 ACCF/AHA guideline for the management of heart failure：a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol，2013，62（16）：e147～239.

3 Hoeschen RJ. Oxadative stress and cardiovascular disease. Can J. Cardiol，2009，13（11）：102.

4 周鹏.前列地尔对老年慢性心力衰竭患者心功能和血管内皮细胞分泌功能的影响.中国老年学杂志，2013，6（33）：2874～2876.

5 Hunting CB，Noort WA，Zwaginga JJ. CEC reflect the state of endothelium vascular injury，repair and neovascularization. Vox Sang，2005， 88（1）：1～9.

6 VilaM， Martinez-salesV， AlmenarL，et al. Inflammation， endothelial dysfunction and angiogenesis markers in chronic heart failure patients. Int J Cardio， 2008，130（2）：276～277.

7 Salomaa V，Wu KK. Soluble thrombomodul in as predictor of incident coronary heart disease.Lancet，1999，354（9190）：1646～1647.

8 田云，卢向阳，易克，等.单细胞凝胶电泳技术.生命的化学，2004，24（1）：77～78.

9 郑卫星，盖晓波，南柏松.充血性心力衰竭患者血管内皮细胞损伤及其临床意义.中国循环杂志，1995，10（4）：195～197.

10 王矩伟，王锡田，陈春波，等.充血性心力衰竭患者血管内皮细胞的变化.郑州大学学报（医学版），2002，1（37）：36～37.

11 倪丰广.丹参酮ⅡA 治疗慢性充血性心力衰竭临床观察.中国中医急症，2012，2（4）：618～619.

12 李博，韩碧园，叶贵娣，等.丹参酮ⅡA对慢性心力衰竭患者心功能的作用及机制.山东医药，2010，50（33）：36～38.

Objective To study the effect of tanshinoneⅡA（TanⅡA）on the vascular endothelial cell（VEC）injury induced by the serum of the patients with chronic heart failure（CHF），and to explore the mechanism of action further. Methods The human umbilicus vein endothelial cells（CRL-1730）were injured by the 15% serum of the patients with CHF，then treated with different concentrations of TanⅡA（10μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml）for 24hours.The activity and the DNA damage of the VEC were determined.The level of the circulating endothelial cells（CEC），von willebrand factor（vWF）and thrombomodulin（TM）in the supernatant were also determined. Results Compare to the healthy control group，the activity of the VEC in the model group was decreasesd（P＜0. 05），the percentage of tail DNA，tail extent and the olive tail moment were increased（P＜0.05），the level of the CEC，VWF and TM were increased（P＜0.05）. Compare to the model group，20 μg / ml and 40 μg / ml TanⅡA can increase the activity of the VEC（P＜0.05），reduce the cell DNA damage（P＜0.05），all the three dose of TanⅡA can decrease the level of CEC，and 20 μg / ml and 40 μg / ml TanⅡA can decrease the level of vWF（P＜0.05），and only the 40μg/ml TanⅡA can decrease the level of TM（P＜0.05）. Conclusion TanⅡA has a protective effect on the VEC by reducing the damage of the cell DNA maybe one of the mechanism in treating CHF.

TanshinoneⅡA Chronic heart failure Vascular endothelial cell DNA damage

广东省佛山市医学类科技攻关项目（201308196）

528200 广东省中西医结合医院（彭环庆 彭志允 谢维宁 范志勇 唐钟祥 林辉文 李烽辉 王颖菁 黄振）528000 广东省佛山科学技术学院（张志坚）