张雪娇，于雷，陈洋，曹忠君，田亚平⋆

（1.辽宁省铁岭市畜产品安全检测站，辽宁铁岭112000；2.中国动物疫病预防控制中心，北京102609）

UPLC-MS/MS法测定动物源食品中42种兽药残留

张雪娇1，于雷2，陈洋1，曹忠君1，田亚平2⋆

（1.辽宁省铁岭市畜产品安全检测站，辽宁铁岭112000；2.中国动物疫病预防控制中心，北京102609）

本研究建立动物源性食品中10种β-受体激动剂类药物、14种喹诺酮类药物和18种磺胺类药物的UPLCMS/MS分析方法，为食品安全监测提供数据支撑。样品用三氯乙酸乙腈提取并去除蛋白质，目标药物用W aters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以0.05%甲酸水溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱，流速: 0.25 m L/m in，柱温:30℃，进样量：10 μL。结果显示，喹诺酮及磺胺类药物在1.0～100.0 ng/m L的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.996；检测限为0.5 ng/m L，定量限为1.0 ng/m L。对于β-受体激动剂类药物在1.0～100.0 ng/m L的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）均大于0.992；检测限为0.5 ng/m L，定量限为1.0 ng/m L。经方法学验证，本方法专属性好，简便准确快速，适用于动物源性食品中兽药残留的检测。

β-受体激动剂类药物；喹诺酮类药物；磺胺类药物；高效液相色谱串联质谱

对动物性食品中的兽药残留进行监控的一个重要手段就是建立快速准确的残留分析方法。目前，关于兽药残留的检测方法主要有液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/MS）等[1-4]。已有的方法常有灵敏度不高、前处理繁琐、检测药物单一或重现性不好等问题，很难满足对药物残留的同时确证检测，但在实际工作中，由于动物性食品安全的保证需要多个指标进行综合指证，因此，单个样本常需要多次检测工作，极大地浪费了人力、物力及财力[5-9]。多残留的检测能够更好地节省时间、提高工作效率，并能更加有效地监测动物产品的安全性。为保障食品安全提供有效的分析手段，本文建立了超高效液相串联质谱法（UPLC－MS/MS）测定动物源性食品中42种药物残留。

1 试验仪器与试剂

1.1 仪器WATERS TQD超高效液相色谱/三重四极串联质谱联用仪（Waters公司）；MassLynxv 4.1数据处理软件（Waters公司）；Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；KQ-250DB型数控超声波清洗器；TGL18M台式高速离心机。

1.2 材料色谱纯甲醇（Fi s h e r Sc i e n t i f i c公司产品）；色谱纯乙腈（Fisher Scienti f ic公司产品）；超纯水；其他试剂均为分析纯。

特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉（以下简称42种兽药），所用42种药物均是商购获得，各个药物的纯度均高于98.0%。同位素内标克仑特罗-D9、莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D6购于CDN ISOTOPES，纯度大于97%。

2 试验方法

2.1 混合标准溶液及内标溶液的配制分别准确称取42药物对照品0.0100 g，甲醇溶解，置于100 mL容量瓶中，配制成100.0 μg/mL的混合标准储备液。准确吸取上述混合储备液1.0 mL至同一个10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得10.0 μg/mL的混合标准储备液。从中准确吸取1.0 mL的混合标准储备液置于10.0 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得1.00 μg/mL的混合标准工作液。

称取3种同位素内标克仑特罗-D9、莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D6约10 mg，分别置100 mL棕色量瓶中，各自用甲醇配成浓度约为100 μg/mL的储备液，于2～8℃冰箱中保存，将上述3种同位素内标储备液用0.05%甲酸水溶液稀释成均约100 μg/L的混合溶液，即得内标工作液。

2.2 样品的前处理方法首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的动物源性食品5.0 g，置于50 mL的离心管中，加入100 μL的内标工作液，加入10%三氯乙酸：乙腈提取液（V:V= 20:80）10.0 mL，充分匀浆后，超声提取10 min，10000 r/min离心10 min，上清液转移到另一个50 mL离心管中，残渣再用提取液10.0 mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于30℃下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0 mL溶解，涡旋混匀，以10000 r/min的速率高速离心10 min。取适量上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，供UPLCMS/MS测定。

2.3 UPLC条件色谱柱为Wa t e r s Ac q u i t y UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相:A相为甲醇，B相为0.05%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～10.0 min：3.0%A～90.0%A；10.0～10.1 min：90.0%A～3.0%A；10.1～13.0 min：3.0%A；流速为0.25 mL/min；柱温为30℃；进样量为10 μL。

2.4 质谱条件电喷雾离子源（ESI+）；毛细管电压为3.5 KV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为0.5 V；源温为110℃；脱溶剂温度为350℃；脱溶剂气流速为650 L/h；锥孔反吹气流速为50 L/h。

3 结果和讨论

3.1 质谱条件优化将所述的42种药物分别进行MS扫描，确定各个药物的定性离子和定量离子，并优化各个药物离子对的碰撞电压。为了提高分析的灵敏度和专一性，选用多反应监测模式（M u l t i-R ea c t i o n M o n i t o r i n g，MRM）进行检测，并同时进行定性和定量的双离子通道分析，进而进一步提高该方法的定性准确性和专属性。42种药物保留时间、定性离子对和定量离子对见表1。为了增强方法的灵敏度，本研究进行多时间段的多反应检测扫描，即按照待测药物的保留时间，分为多个时间段分别进行MRM扫描，以增加每个药物的扫描时间，进而提高灵敏度。具体来说，根据各个药物的保留时间确定监测时间，得到测定结果见表2。

表1 42种药物的保留时间、定性离子对和定量离子对Table1 The retention tim e,qualitative ion,quantification ion o f 42 drugs

表2 42种药物的m pMRM参数Table2 The multiple reaction monitoring(MRM)of 42 drugs

药物时间（min）mpMRM监测离子碰撞电压（V）磺胺邻二甲氧嘧啶（Sul fadoxine）5.0～5.6磺胺嘧啶（Sul fadiazine）3.2～3.7磺胺噻唑（Sul fathiazole）3.5～4.0磺胺吡啶（Sul fapyridine）3.6～4.0磺胺甲基嘧啶（Sul famerazine）3.8～4.2磺胺二甲基噁唑（Sul famoxol）4.2～4.6磺胺对甲氧嘧啶（Sul fameter）4.3～4.6磺胺二甲嘧啶（Sul famethazine）4.3～4.7磺胺类药物磺胺甲噻二唑（Sul famethizole）4.4～4.7磺胺甲氧哒嗪（Sul famethoxypyridazine）磺胺甲噁唑（Sul famethoxazole）磺胺氯达嗪（Sul fachloropyridazine）磺胺间甲氧嘧啶（Sul famonomethoxine）4.6～4.94.8～5.34.8～5.34.9～5.5磺胺醋酰（Sul facetamide）2.5～5.3磺胺二甲异噁唑（Sul fisoxazole）5.2～5.6磺胺苯吡唑（Sul faphenazole）5.7～6.9磺胺二甲氧嘧啶（Sul fadimethoxine）5.7～6.9磺胺喹噁啉（Sul faquinoxal ine）5.7～6.9311.1＞156.0311.1＞108.1251.1＞156.0251.1＞108.1256.0＞155.9256.0＞92.0250.0＞155.9250.0＞184.0265.0＞155.9265.0＞171.9268.0＞155.9268.0＞113.0281.0＞156.0281.0＞215.1279.0＞186.0279.0＞124.0271.0＞155.9271.0＞92.0281.0＞155.9281.0＞108.0254.0＞155.9254.0＞92.0285.0＞155.9285.0＞108.0281.1＞155.9281.1＞108.0215.1＞156.0215.1＞108.1268.1＞156.0268.1＞113.1301.0＞155.9301.0＞92.0311.0＞155.9311.0＞108.0315.1＞160.1315.1＞156.0202216251525161616151617151716221625162516252515162521161317162517252018

3.2 方法验证

3.2.1 专属性试验阴性样品中定量添加42种药物，并按照前处理方法进行处理，得到色谱图，见图1～3。通过图可以看出，42种药物能和其他色谱峰完全分离，空白组织没有干扰，达到了多药物的同时检测。

图1 β-受体激动剂类药物特征离子质量色谱图Fig.1 Characteristic ion m ass chrom atogram s o f the beta-agonists

图2 喹诺酮类药物特征离子质量色谱图Fig.2 Characteristic ion m ass chrom atogram s o f the quino lones

图3 磺胺类药物特征离子质量色谱图Fig.3 Characteristic ion m ass chrom atogram s o f the su lfonam ides

3.2.2 线性关系和检测限准确量取适量的42个药物的标准液，分别添加到5.0 g健康牛肉中，制得含量为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的系列空白添加试样，按1.2的前处理方法项下所述方法进行处理，然后进行UPLC-MS/MS测定。对于磺胺类及喹诺酮类药物，以各药物定量离子的色谱峰面积为纵坐标，样品浓度（ng/mL）为横坐标，绘制标准曲线，并测定检出限（S/N＞3）和定量限（S/N＞10），对于β-受体激动剂类药物，按内标法以峰面积比计算，结果见表3。

表3 42种药物的标准曲线、定量限和检测限Table3 The linear range,lim it o f detection,lim it o f quantity of 42 drugs

药物氯丙那林（Clorprenal ine）克伦特罗（Clenbuterol）妥布特罗（Tulobuterol）喷布洛尔（Penbutolol）苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A）培氟沙星（Pef loxacin）环丙沙星（Ciprof loxacin）恩诺沙星（Enrof loxacin）氧氟沙星（Of loxacin）伊诺沙星（Enoxacin）吡哌酸（Pipemidic Acid）萘啶酸（Nalidixic Acid）西诺沙星（Cinoxacin）诺氟沙星（Nor f loxacin）达氟沙星（Danof loxacin）洛美沙星（Lomef loxacin）二氟沙星（Di f loxacin）沙氟沙星（Saraf loxacin）司帕沙星（Spar f loxacin）磺胺邻二甲氧嘧啶（Sul fadoxine）磺胺嘧啶（Sul fadiazine）磺胺噻唑（Sul fathiazole）磺胺吡啶（Sul fapyridine）磺胺甲基嘧啶（Sul famerazine）磺胺二甲基噁唑（Sul famoxol）磺胺对甲氧嘧啶（Sul fameter）磺胺二甲嘧啶（Sul famethazine）磺胺甲噻二唑（Sul famethizole）磺胺甲氧哒嗪（Sul famethoxypyridazine）磺胺甲噁唑（Sul famethoxazole）磺胺氯达嗪（Sul fachloropyridazine）磺胺间甲氧嘧啶（Sul famonomethoxine）磺胺醋酰（Sul facetamide）磺胺二甲异噁唑（Sul f isoxazole）磺胺苯吡唑（Sul faphenazole）磺胺二甲氧嘧啶（Sul fadimethoxine）磺胺喹噁啉（Sul faquinoxal ine）标准曲线Y=1.765X-0.430 Y=0.61X-0.058 Y=2.29X-0.633 Y=1.788X-1.363 Y=25.57X+6.75 Y=486X-74.8 Y=293X+7.55 Y=450X+46.7 Y=416X-8.11 Y=555X-23.2 Y=282X-15.8 Y=891X-87.4 Y=410X-19.1 Y=311X+181 Y=558X-65.7 Y=418X-38.3 Y=381X-25.6 Y=141X-4.81 Y=171X-10.0 Y=426X-1.50 Y=149X-4.45 Y=378X-18.9 Y=321X-23.5 Y=237X-25.0 Y=386X-13.0 Y=229X+8.68 Y=365X+1.05 Y=391X+1.48 Y=419X-27.6 Y=211X+4.54 Y=296X-17.1 Y=275X+7.7 Y=139X+9.82 Y=291X+10.2 Y=138X-10.7 Y=359X-64.3 Y=408X-65.2 r 0.9980.9980.9980.9970.9960.9980.9990.9990.9990.9980.9990.9990.9980.9960.9970.9990.9990.9970.9980.9990.9980.9980.9980.9990.9990.9980.9980.9970.9990.9960.9990.9980.9990.9980.9970.9990.999 LOD（ng/mL）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5 LOQ（ng/mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0

通过表3数据可以看出，喹诺酮及磺胺类药物在1.0～100.0 ng/mL的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.996；检测限为0.5 ng/mL，定量限为1.0 ng/mL。对于β-受体激动剂类药物，按内标法以峰面积比计算，结果表明，10种β-受体激动剂类药物在1.0～100.0 ng/mL的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）均大于0.992；检测限为0.5 ng/mL，定量限为1.0 ng/mL。上述数据说明本发明检测方法灵敏度高，检测限和定量限较低。

3.2.3 回收率和精密度试验准确量取适量的42种药物的标准液，配制高、中、低浓度的42种标准溶液，分别添加到5.0 g健康牛肉中，按照2.1的样品前处理方法项下处理样品，并测定药物浓度，每个浓度测定6个样本，每个浓度的测得量与加入量相比，最终得回收率。日内精密度按高、中、低3个浓度分别在1 d的不同时间测6次进行计算，日间精密度按高、中、低浓度连续测定3 d进行计算。

表4 42种药物的准确度及精密度Tab le4 The accuracy and precision o f 42 drugs

吡哌酸（Pipemidic Acid）萘啶酸（Nalidixic Acid）西诺沙星（Cinoxacin）诺氟沙星（Nor f loxacin）达氟沙星（Danof loxacin）洛美沙星（Lomef loxacin）二氟沙星（Di f loxacin）沙氟沙星（Saraf loxacin）司帕沙星（Spar f loxacin）磺胺邻二甲氧嘧啶（Sul fadoxine）磺胺嘧啶（Sul fadiazine）磺胺噻唑（Sul fathiazole）磺胺吡啶（Sul fapyridine）磺胺甲基嘧啶（Sul famerazine）磺胺二甲基噁唑（Sul famoxol）1.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.086.3±9.088.3±6.593.3±6.985.2±6.688.9±6.089.6±5.886.3±9.688.5±5.091.1±5.887.1±9.590.3±5.991.0±5.287.3±6.588.9±5.693.2±5.589.6±9.896.3±4.995.2±5.587.6±9.896.3±5.298.9±5.587.0±9.593.3±6.493.4±5.588.2±9.988.4±4.293.3±4.384.9±9.893.6±7.896.4±4.291.1±9.395.3±6.593.3±6.985.2±9.688.2±4.595.9±5.886.3±8.385.5±5.895.1±5.888.1±6.391.3±5.990.3±5.289.3±6.389.2±3.698.9±5.27.36.15.08.84.07.88.74.86.08.05.37.08.53.87.86.06.94.86.54.85.38.05.53.98.84.96.78.26.94.89.55.25.99.06.55.89.94.77.98.87.55.96.15.93.88.48.64.85.35.910.78.35.26.19.65.47.04.85.35.910.42.35.09.78.65.411.04.85.36.910.06.35.53.57.610.411.44.05.37.910.34.35.23.16.96.65.411.14.85.3

磺胺对甲氧嘧啶（Sul fameter）磺胺二甲嘧啶（Sul famethazine）磺胺甲噻二唑（Sul famethizole）磺胺甲氧哒嗪（Sul famethoxypyridazine）磺胺甲噁唑（Sul famethoxazole）磺胺氯达嗪（Sul fachloropyridazine）磺胺间甲氧嘧啶（Sul famonomethoxine）磺胺醋酰（Sul facetamide）磺胺二甲异噁唑（Sul f isoxazole）磺胺苯吡唑（Sul faphenazole）磺胺二甲氧嘧啶（Sul fadimethoxine）磺胺喹噁啉（Sul faquinoxal ine）1.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.01.05.050.088.6±7.396.3±4.5105.2±5.488.6±7.889.3±5.390.3±5.490.0±6.593.3±6.393.4±5.8102.2±5.886.4±4.393.3±4.492.1±6.393.6±7.896.4±4.3101.1±7.485.3±6.393.3±6.885.2±3.684.2±3.595.6±5.896.3±4.885.5±5.895.1±5.395.1±4.591.3±5.390.3±5.383.3±6.384.2±3.688.2±5.295.6±7.896.3±4.595.2±5.397.6±7.886.3±5.588.3±5.37.88.86.58.99.14.88.98.38.79.93.86.88.87.99.88.74.85.311.19.23.89.85.89.74.86.14.85.36.15.23.85.88.86.74.88.18.95.72.38.28.79.65.46.57.19.89.59.910.78.35.23.77.65.411.18.88.310.910.78.35.24.65.65.45.14.85.35.95.79.35.26.1

通过表4可以看出，本方法的准确度在80%～110%，日内精密度在10%以下，日间精密度在12%以下，大部分的日间精密度在10%以下。这说明该方法准确度高，且重现性良好。

4 实际样品分析

在市场中随机抽取了30份猪肉样品，对样品中的42种药物进行检测，结果在30份样品中，发现样品编号为CL20140072、CL20140079、CL20140081的样品中含有磺胺二甲嘧啶，浓度分别为4.38、4.41、4.34 μg/kg，低于农业部235公告规定的MRL值。进一步表明本研究所建立的方法有效，能够检测到在动物可食性组织中药物残留，且有较强的应用性。

5 结论

本研究采用UPLC-MS/MS技术建立了测定动物源食品中42种兽药残留方法。该方法操作简单、方便，具有良好的线性关系和较好的回收率和准确度。此外，质谱扫描采用MRM扫描模式，从而显著提高了灵敏度，适合对动物源食品中β受体激动剂类药物、喹诺酮类药物和磺胺类药物进行快速含量测定，以及筛查和确证。

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Determ ination of 42 drugs Residues in Animal Derived food by UPLC-MS/MS

Zhang Xuej iao1,Yu Lei2,Chen Yang1,Cao Zhongjun1,Tian Yaping2*

(1.Tiel ing Livestock Product Safety Inspection Station,Liaoning Tiel ing 112000; 2.China Animal Disease Control Center，Bei jing 100125)

To develop a UPLC－MS/MS analysis method for the determ ination of 10 beta-agonists,14 quinolones and 18 sulfonam ides so as to provide data support for guaranteeing food safety.The samples were extracted w ith trichloroacetic acid and acetonitrile.W aters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)was used as separation column.And the mobile phase was 0.05%form ic acid in water-methanol for gradient elution.The flow rate was 0.25 m L/ m in,the column temperature was 30℃,the injection volume was 10 μL.Quinolone and sulfa drugs in the concentration range of 1.0～100.0 ng/m L showed a good linear relationship，and the linear correlation coefficient was above 0.996, the detection limit was 0.5 ng/m L,the quantification lim it was 1.0 ng/m L.The linear relationship for beta-agonists in range of 1.0～100.0 ng/m L was also well,the linear correlation coefficient was above 0.992,the detection lim it was 0.5 ng/m L,the quantification lim it was 1.0 ng/m L.The methodology validation shows that the established method is specific,simple,accurate and rapid,which can be used to determ ine 42 drugs.

Beta-agonists;Quinolones;Sulfonam ides;UPLC-MS/MS

S859.84

B

1672-9692(2015)03-0009-14

2015-03-09

张雪娇（1971-），女，本科，兽医师、会计师，主要从事兽药残留新方法研究。

田亚平（1983-），女，博士，工程师，主要从事兽药残留新方法研究。