李岩

（黑龙江省绥化市青冈县畜牧兽医局，黑龙江青冈151600）

H 6亚型鸭源流感病毒HA基因序列分析

李岩

（黑龙江省绥化市青冈县畜牧兽医局，黑龙江青冈151600）

为了研究H6亚型禽流感病毒的分子特征，本研究从鸭的咽喉拭子样本中分离到一株禽流感病毒，通过血凝抑制试验证实该分离株为H 6亚型流感病毒，命名为A/duck/Heilongjiang/QG1/2013(H 6)。对其血凝素基因进行了克隆和序列分析，结果表明分离株与我国鸭源禽流感病毒A/duck/Guangxi/585/2005(H 6N 5)的同源性最高，达到97.8%。系统发育树分析进一步证实分离株与A/duck/Guangxi/585/2005(H 6N 5)的亲缘关系最近，共同起源于台湾分离株A/chicken/Taiwan/G23/87(H 6N 1)。本研究为H 6亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据。

鸭；禽流感病毒；H 6亚型；HA基因；序列分析

禽流感（Avina inf luenza,AI）是由正黏病毒科、流感病毒属的A型禽流感病毒（Avina inf luenza virus,AIV）引起的禽类感染或疾病综合征，广泛流行于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。1994年，美国动物卫生协会根据AIV致病性的不同将其分为高致病性、低致病性和无致病性三种，但习惯上将后两者统称为低致病性AIV。在所有的亚型组合中，只有部分H5和H7亚型属于高致病性AIV，其他亚型皆表现为低致病力[1-2]。高致病性AIV严重危害养禽业并已威胁到人类健康，引起普遍的关注。低致病性AIV可导致禽类出现轻度呼吸道症状、食欲不振、产蛋量下降，导致禽的零星死亡，给禽类养殖者造成的损失也相当严重，但关于低致病性AIV除了H9N2亚型的报道较多外[3-4]，其他亚型报道的相对较少。本研究从健康鸭咽喉拭子分离到一株H6亚型AIV，并对其HA基因进行了序列分析，报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料AMV Re v e r s e T r a n s c r i ptase、RNase Inhibitor、Ex Taq聚合酶、dNTPs等购自大连宝生物工程公司；AxyPrep体液病毒DNA/ RNA小量制备试剂盒、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自康宁生命科学（吴江）有限公司。H6亚型AIV标准阳性血清和新城疫病毒（Newcast le disease virus,NDV）由哈尔滨兽医研究所国家动物流感参考实验室提供；9～11日龄SPF鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。鸭咽喉拭子采自黑龙江省青冈县某养殖户的家鸭。

1.2 病毒的分离及H A亚型鉴定病料按常规方法处理，接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.2 mL，37℃孵化72 h后，收集鸡胚尿囊液，测定血凝价。将具有血凝价的鸡胚尿囊液先与NDV标准阳性血清进行血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验，NDV HI试验阴性的鸡胚尿囊液再与流感病毒H6标准阳性血清进行HI试验，具体操作程序与判断标准按文献进行[5]。将鉴定过的病毒分装，保存于-70℃备用。

1.3 引物设计根据流感数据库中H 6亚型A I V基因序列设计HA基因特异性引物，引物由上海英俊生物公司合成。反转录引物序列Uni12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。HA基因特异性上游引物序列：HA6-up:5’-TTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’，HA6-low:5’-ATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTT-3’。

1.4 病毒提取、c D N A合成及H A基因的克隆取200 μL病毒尿囊液，按照AxyPrep体液病毒DNA/ RNA小量制备试剂盒说明书提取病毒和核酸。用AIV反转录通用引物Uni-12按照AMV Reverse Transcriptase使用说明书进行反转录合成cDNA。用HA基因特异性引物进行PCR扩增，随后用1%琼脂糖凝胶进行电泳，然后将PCR产物经胶回收纯化后连接pMD-18T载体，并进行鉴定，挑选阳性克隆[6]。

1.5 H A基因测序及序列分析挑选3个上述鉴定为阳性的克隆送往上海英俊生物公司，用pMD-18T载体测序引物进行测序。用DNAStar程序中的Seqman软件对测得的序列进行拼接。从GenBank中下载H6亚型AIV参考毒株HA基因序列，用DNAStar程序中的MegAlign软件进行同源性比对；用MEGA5.0软件中的邻接法绘制HA基因的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病毒的分离及鉴定病料接种鸡胚后收集的尿囊液能够凝集鸡红细胞，经多次鸡胚传代后血凝价能够达到210。NDV阳性血清不能够对该尿囊液产生抑制作用，而H6亚型AIV标准阳性血清能够产生很高的抑制作用，血凝抑制效价达到8log2。

图1 HA基因PCR扩增产物Fig.1 PCR p roduct of HA gene

2.2 HA基因的克隆用H 6亚型A I V HA基因特异性引物对尿囊液中提取的RNA进行RT-PCR扩增，产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，可见在1744 bp左右处出现特异性条带，与预期结果相符，见图1。

2.3 H A基因的序列分析将测序的H A基因序列经DNAStar软件包中的Seqman软件校对拼接，获得完整的HA基因全长序列，为1744 nt，开放阅读框位于18～1718 nt之间，为1701 nt。登陆Genbank，经Blast搜索比对，用DNAStar程序中的MegAlign软件进行同源性比对，发现分离株HA基因完整开放阅读框序列及编码的蛋白序列与Genbank中收录H6N5亚型鸭源AIV A/duck/Guangxi/ 585/2005（H6N5）的HA基因核苷酸和氨基酸序列同源率最高，分别为97.8%和98.1%。根据流感病毒通用命名法则，将该分离株命名为A/duck/Heilongjiang/QG1/2013（H6）。在蛋白水平上，HA基因编码566个氨基酸的蛋白，分离株HA蛋白裂解位点附近氨基酸残基为-PQIETR↓GLF-，符合低致病性AIV的分子特征。NetNGlyc 1.0 Server N-糖基化预测软件分析表明分离株的HA蛋白中含有5个潜在的糖基化位点，分别为位于27位的NST，39位的NVT，182位的NNT，306位的NKT，557位的NGS。

2.4 H A基因系统发育树的绘制本研究选择G e nbank中收录的国内H6亚型AIV的HA基因核苷酸序列来绘制系统发育树。研究表明我国H6亚型AIV HA基因演化为五个分支，见图2。本研究中分离株HA基因与A/duck/Guangxi/585/2005（H6N5）的HA基因亲缘关系最近，共同起源于台湾分离株A/chicken/ Taiwan/G23/87（H6N1）。

图2 HA基因系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree o f HA gene

3 讨论

H6亚型禽流感病毒为低致病力流感病毒，虽然在自然界中普遍存在，但是一般不引起宿主产生临床症状，因此一直没有引起人们的重视。30多年全球鸟类禽流感流行病学监测中，在北美地区、欧洲、伏尔加河、里海北部、西伯利亚、日本和我国台湾都曾分离得到H6亚型AIV[7-8],而且H6亚型在北美地区及欧洲还是优势亚型。近年来，我国H6亚型AIV的分离报道也逐渐增多。2000～2005年间，Cheung等从广东汕头活禽市场的禽类中分离到414株H6N1和H6N2亚型AIV，表明H6亚型AIV在我国流行较为普遍[9]。值得关注的是我国学者在进行人血清流行病学调查时也发现可以检测到H6亚型AIV抗体[10]，表明H6亚型AIV可以感染人，具有向人群侵袭的趋势。本研究结果表明分离到了一株AIV A/ duck/Hei longj iang/QG1/2013（H6），其HA基因来源于H6N5亚型AIV，分子生物学分析进一步证明其是一株低致病性H6亚型AIV。

Chin等2002年在华南陆生禽类分离到AIV A/ teal/Hong Kong/W312/97（H6N1）的6个内部基因与致人死亡流感病毒分离株A/Hong Kong/156/97（H5N1）高度同源[11]，这警示我们H6亚型禽流感病毒具有重要的公共卫生意义。因此对H6亚型低致病性毒株引起的AI，也应保持高度警惕。

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HA gene analysis of a H6 subtype avian influenza virus isolated from domestic duck

Li Yan

（Animal husbandry and veterinary bureau of Qinggang,Heilongj iang Suihua 151600）

To investigate the molecular characteristics of H6 subtype avian inf luenza virus,the isolation of virus f rom the throat swabs of ducks was conducted.A H6 subtype avian inf luenza virus A/duck/Hei longjiang/QG1/2013(H6)was isolated and identi fied by hemagglutination inhibition tests.The hemagglutinin gene was cloned and analyzed.The resul ts showed that the virus was closely related with AIV A/duck/Guangxi/585/2005(H6N5)with the highest homology of 97.8%.Phylogenetic t ree analysis further confirmed that the HA gene of the isolate derived f rom AIV A/chicken/Taiwan/ G23/87(H6N1)isolated f rom Taiwan.The research has added new data for the H6 subtype of avian inf luenza epidemiological studies.

Duck;Avian inf luenza virus;H6 subtype;HA gene;Sequence analysis

S852.65

B

1672-9692(2015)04-0005-04

2015-02-19

李岩（1974-），男，本科，高级兽医师，从事畜牧兽医技术推广和动物疾病诊疗工作。