陈仕学等

摘要：用微波辅助提取茶叶蛋白质，并用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量，以NaOH浓度、料液比、微波时间和微波功率为参考因素设计试验，通过单因素试验和正交试验确定了茶叶蛋白质的最佳提取工艺参数，筛选出最佳组合。结果表明，微波辅助提取茶叶蛋白质的最佳条件为：NaOH浓度0.12 mol/L，料液比1∶30（g∶mL），微波时间115 s，微波功率440 W。在此条件下，茶叶蛋白质提取率达到11.26%。另外还对茶叶蛋白质的吸水性、吸油性和持水性进行了研究，其中提取得到的茶叶蛋白质吸水量为1.797 mL/g，吸油量为0.998 mL/g，持水能力为 1.64 g/g。由此可知，微波辅助提取法大大缩短了浸提时间，提高了茶叶蛋白质的提取率。

关键词：微波辅助提取；茶叶；蛋白质；理化性质

中图分类号：S571.1；TS272.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4552-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.040

茶树（Camellia sinensis）属于山茶科山茶属多年生常绿木本植物，中国有14属397种。茶叶在人们的生活中具有饮用、营养、保健、药理、人文等多元价值[1]，可以作为保健饮品开发[2]，中国具有丰富的茶叶资源[3]。茶叶中蛋白质含量一般占茶鲜叶干重的15%～30%，其中大部分为非水溶性蛋白质[4]，只有1%～2%的蛋白质为水溶性蛋白质[5]。目前，对茶叶蛋白质的研究主要有：李燕等[6]用小鼠进行茶叶蛋白质预防辐射，发现茶叶蛋白质具有清除超氧阴离子的功能，可抵抗电离辐射所引起的致突变效应。活泼等[7]研究发现非水溶性茶叶蛋白质有明显的降血脂效果，对抗动脉粥样硬化及冠心病有一定的预防作用。陆晨等[8]在研究茶叶蛋白质对面团流变学特性的影响中，得出茶叶蛋白质可以作为有效的面粉营养强化剂和面粉品质改良剂。由此可知，茶叶蛋白质是一种既有营养又有多种保健功能的蛋白质。

目前对茶叶蛋白质的提取工艺研究鲜有报道，有关的报道仅集中于茶叶蛋白质的单一碱溶法提取工艺研究[9]。微波提取技术是近年来新发展的一种方法，其提取技术因操作方便、提取效率高、能耗小等特点，已被广泛应用到食品原料及天然产物中目标功效成分的提取[10]。因此，本试验以梵净山绿茶为原料，用微波辅助提取茶叶蛋白质，得出提取茶叶蛋白质的最佳工艺条件，并对其理化性质进行研究，旨在为茶叶蛋白的深加工提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：梵净山绿茶。

试剂：NaOH、牛血清白蛋白质、活性炭、90%乙醇、85%磷酸、乙酸乙酯、盐酸；标准蛋白质溶液：称取10 mg牛血清白蛋白质，溶于去离子水并定容至100 mL，制成 0.1 mg/mL的原液；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL95%乙醇中，加入85%的磷酸100 mL，用去离子水定容到1 000 mL。

仪器：FW80型万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司；秒表，深圳市超速达实业有限公司；MM823EC8-PS（X）型美的微波炉，佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司；101-3型电热鼓风干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司；紫外分光光度计，北京普析通用仪器公司；80-2型离心沉淀机，江苏金坛市中大仪器厂；HH-2型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制作 取6支试管，向各试管分别加入0.1 mg/mL的标准蛋白质溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，去离子水补足1 mL，分别加5 mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，轻轻摇匀。放置2 min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 1 h内完成）。以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出蛋白质标准曲线[11]，得出回归方程y=kx+b。

1.2.2 茶叶蛋白质的提取工艺流程 原料预处理（将茶叶用乙酸乙酯进行清洗除脂，干燥后粉碎备用）→茶蛋白质浸提（微波辅助碱提，制得茶叶蛋白质提取液）→真空抽滤、取滤液→脱色（活性炭脱色30 min，每100 mL提取液加入4 g活性炭）→抽滤取滤液→得到茶叶蛋白质提取液→考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量[12-14]。

1.2.3 单因素试验

1）NaOH浓度。准确称取1 g预处理好的茶叶6份，以料液比为1∶30（g∶mL，下同）分别加入0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mol/L NaOH溶液，微波功率为440 W，微波辅助提取时间为75 s，按照“1.2.2”的方法进行试验，探讨不同NaOH浓度对其提取率的影响。

2）料液比。准确称取1 g预处理好的茶叶6份，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，微波功率为440 W，微波辅助提取时间为75 s，按照“1.2.2”的方法进行试验，探讨不同料液比对其提取率的影响。

3）微波时间。准确称取1 g预处理好的茶叶6份，微波时间分别为55、75、95、115、135、155 s，按照“1.2.2”的方法进行试验，探讨不同时间对其提取率的影响。

4）微波功率。准确称取1 g预处理好的茶叶6份，微波功率为136、264、440、616、800 W，按照“1.2.2”的方法进行试验，探讨不同功率对其提取率的影响。

1.2.4 正交试验 在单因素试验的基础上，以NaOH浓度、料液比、微波时间、微波功率为试验因素，以茶叶蛋白质提取率为指标，进行4因素3水平的正交试验。

1.2.5 茶叶蛋白质的性质研究

1）茶叶蛋白质干品的制备。利用碱提酸沉法，将得到的茶叶蛋白质提取液中加入0.01 moL/L盐酸并调节pH至蛋白质的等电点使蛋白质沉淀出来，离心后取沉淀烘干制成蛋白质干品备用。

2）吸水性测定。称取0.5 g干燥茶叶蛋白质置于干燥离心管中，再加入5 mL去离子水，在室温下静置30 min，4 000 r/min离心30 min，测量上清液体积，用原水体积减去离心后上清液体积即为蛋白样品的吸水性。

吸水性=（原水体积-离心后上清液体积）/蛋白质质量

3）吸油性测定。取0.5 g干燥茶叶蛋白质置于干燥离心管中，加5 mL 清油置于离心管中，混匀1 min 后，在室温下静置30 min，4 000 r/min离心30 min，测量游离油体积，原油量减去游离油量即为蛋白质样品所吸油性。

吸油性=（原油量-离心后游离油量）/蛋白质质量

4）持水性测定。称取0.5 g茶叶蛋白质置于干燥离心管中，加入10 mL去离子水，搅拌均匀后80 ℃水浴加热60 min，冷却至室温，4 000 r/min离心10 min后去上清液，擦干离心管内壁和外壁的水分，称取沉淀的质量，计算出每毫克蛋白质样品的持水性[15]。

持水性=沉淀质量/样品质量

2 结果与分析

2.1 蛋白质标准曲线

用考马斯亮蓝对标准蛋白质溶液进行染色， 595 nm波长下测定其吸光度，以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（图1），得出回归方程y=7.985 0x-0.009 0 （R2=0.999 2）。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 NaOH浓度对提取率的影响 NaOH浓度对茶叶蛋白质提取率的影响见图2。由图2可知，随着NaOH浓度的升高，茶叶中蛋白质的提取率不断增大，当NaOH浓度达到0.12 moL/L时，茶叶蛋白质的提取率达到最大，之后随着NaOH浓度的持续增加蛋白质提取率又有了下降的趋势，表明在NaOH溶液为0.12 moL/L时，大部分蛋白质溶出，当NaOH浓度较高时，会使蛋白质变性和水解，还会改变蛋白质的营养学特性，生成赖氨酰丙氨酸[16]。另外，碱浓度过高还会影响分离效果[17]。所以随着NaOH浓度的持续增加，蛋白质提取率逐渐下降。因此，确定微波辅助提取茶叶蛋白质的最佳NaOH浓度为0.12 moL/L。

2.2.2 料液比对提取率的影响 不同料液比对茶叶蛋白质提取率的影响见图3。由图3可知，随着料液比的降低，茶叶蛋白质的提取率逐渐增大，当料液比达到1∶30时提取率达到最大，随着料液比的持续降低，茶叶中蛋白质的提取率又逐渐下降，另外溶剂太多，会造成提取液中蛋白质浓度偏低，也会增加后面处理的负担。所以料液比1∶30为其最佳料液比。

2.2.3 微波时间对提取率的影响 不同时间对茶叶蛋白质提取率的影响见图4。由图4可知，开始时随着微波时间的增加，茶叶蛋白质提取率呈现增大的趋势，当微波提取时间达到135 s时茶叶蛋白质提取率达到最大，然后随着时间的延长，茶叶蛋白质提取率呈下降趋势，可能是由于微波时间过长，持续的高温使茶叶蛋白质变性失活，变性失活的蛋白质与考马斯亮蓝不能染色，导致其提取率下降。所以微波辅助提取茶叶蛋白质的最佳时间为135 s。

2.2.4 微波功率对提取率的影响 不同功率对茶叶蛋白质提取率的影响结果见图5。由图5可知，随着微波功率的增大，茶叶蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势，当微波功率达到440 W时，提取率达到最大，之后随着微波功率的不断增大，茶叶蛋白质的提取率反而逐渐下降，这可能是由于微波功率过大易造成温度过高而使蛋白质变性失活，最终导致蛋白质的提取率下降。所以微波辅助提取茶叶蛋白质的最佳功率为440 W。

2.3 正交试验结果

为了研究不同条件对蛋白质提取率的影响和确定最佳蛋白质提取工艺，根据以上单因素试验选择了对提取率影响较大的NaOH浓度、料液比、微波时间、微波功率4个因素3水平（表1），采用 L9（34）进行试验，以蛋白质提取率为指标，结果见表2。由表2正交试验结果可知，在碱性条件下利用微波提取茶叶蛋白质过程中，发现影响茶叶蛋白提取率的主次因素依次为：料液比>微波时间>微波功率>NaOH浓度，提取的最佳方案为A2B2C1D2，即NaOH浓度为0.12 moL/L、料液比为1∶30、微波提取时间为115 s、微波功率为440 W。为了考察上述提取工艺的稳定性，按该工艺的最佳条件，进行5次重复性试验得出茶叶蛋白质的平均提取率为11.26%，优于正交试验中的任何一组，且RSD为2.29%，说明该工艺稳定。

2.4 精密度试验

在最佳提取工艺条件下称取5份样品提取蛋白质，用考马斯亮蓝染色法对提取的蛋白质溶液进行染色，并用紫外分光光度计测量其吸光度，计算茶叶蛋白质提取率[18]，5次试验的RSD为0.17%，说明用此方法测量茶叶蛋白质提取率的精密度较好。

2.5 蛋白质性质测定

蛋白质的吸水性表示蛋白质的水化能力，即蛋白质分子通过直接吸附及松散结合而在其分子周围形成水化层的能力。蛋白质的吸油性是指蛋白质与游离脂肪相结合的能力[19]。蛋白质的持水性是蛋白质功能特性中的一种，是指蛋白质在一定条件下承受热加工后保持水分的能力。试验对茶叶蛋白质的吸水性、吸油性和持水性进行了测定，测得茶叶蛋白质的吸水量为1.797 mL/g，吸油量为0.998 mL/g，持水能力为1.64 g/g。

3 结论

试验以微波辅助法提取梵净山绿茶茶叶中的蛋白质，分别对NaOH浓度、料液比、微波功率、微波时间等因素进行单因素试验，并通过正交试验得到的最佳提取工艺条件为：NaOH浓度为0.12 moL/L，料液比为1∶30，微波时间为115 s，微波功率为440 W，在此条件下茶叶蛋白质的提取率为11.26%。与传统提取工艺比较，微波辅助提取用时少，速度快，效率高。此外，试验还对茶叶蛋白质的吸水性、吸油性和持水性进行了研究，结果表明，吸水量为1.797 mL/g，吸油量为0.998 mL/g，持水能力为1.64 g/g。茶叶蛋白质虽然大部分为非水溶性蛋白质，不能直接被人体吸收利用，但若对其进行改性，可以被人体吸收利用，本试验对茶叶蛋白质的性质进行初步研究，为以后对茶叶的深加工研究提供一定依据。

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