田玉民，苏玉虹，王玉彬，高群，张会君，王铁良

（辽宁医学院，辽宁锦州121001）

抗野猪和地方猪仔猪营养性腹泻的研究

田玉民，苏玉虹，王玉彬，高群，张会君，王铁良

（辽宁医学院，辽宁锦州121001）

野猪和地方猪养殖过程中仔猪营养性腹泻率高，严重地影响了养殖的经济效益。本研究通过PCR扩增和DNA测序，检测到猪乳糖酶基因（LCT）5′非编码区增强子和启动子多态性位点；通过双荧光报告系统实验，确定了LCT多态性位点调控基因的表达；经统计分析，LCT多态性与仔猪乳糖消化性状相关显著。通过饲养试验，筛选了抗腹泻饲料添加剂。上述研究形成了抗野猪和地方猪仔猪营养性腹泻的综合配套技术，为后续推广应用奠定了基础。

野猪仔猪；地方猪仔猪；营养性腹泻；乳糖酶基因；饲料添加剂

猪肉是我国肉类消费的主体，占肉类总消费的60%以上[1]。据统计，2012年我国猪肉产量5 342.7万吨，人均猪肉消费量38.7 kg，猪肉消费基本趋于饱和，消费理念由追求数量转向追求质量[2]。与国内占优势的国外猪种相比，我国地方猪肉质在色泽、嫩度、大理石纹、pH值、系水力及脂肪酸含量等方面均有不同程度的优势[3]，地方猪和野猪猪肉产品在猪肉供应市场上占有一定的份额，并有逐步提高的趋势，地方猪的养殖生产在逐步走向规模化。

随着地方猪和野猪生产的规模化，疫病防控、繁殖、营养饲料等一些问题也逐渐暴露出来，特别是仔猪腹泻率高、成活率低的问题比较突出。2010年，本研究团队在与企业产学研合作过程中发现，即使在猪群健康状况非常良好、饲料配方和饲料原料来源比较稳定时，野猪和地方猪仔猪腹泻率也比较高，成为制约经济效益的重要因素之一。本研究围绕这一现象开展了相关调查和试验研究，最终确定为营养性腹泻，通过分子遗传学方法探明了该腹泻的发生原因，并开发出了相应的抗腹泻饲料添加剂和分子辅助育种技术。

1 材料与方法

1.1 猪LCT基因的多态性及对基因表达的影响采取大白猪、长白猪、杜洛克、荷包猪、民猪、长白山野猪仔猪耳组织样本，提取DNA，通过对乳糖酶（lactase,LCT）基因进行PCR扩增和DNA测序，获得LCT基因5'非编码区增强子和启动子多态性位点[4]。通过单倍型双荧光报告系统试验，确定LCT多态性位点对基因表达的影响[5]。

1.2 LCT基因的多态性与仔猪营养性腹泻的相关分析取荷包猪、民猪、长白山野猪腹泻仔猪粪便，测定粪便乳糖和pH；取仔猪耳组织样本，提取DNA，分析LCT基因多态性，并采用SPSS软件包（version 17.0）分析该多态性与仔猪腹泻的相关关系[6]。

1.3 抗仔猪营养性腹泻饲料添加剂的筛选经挑选整齐的野猪和荷包猪仔猪（哺乳和摄入含乳制品仔猪料）135头，随机分为9个处理组，每组15头，每组分3个重复。第1组为空白对照组，饲喂基础日粮；第2组饲喂寡果糖—FOS（150 mg/kg）；第3组饲喂寡甘露糖—MOS（200 mg/kg）；第4组饲喂寡果糖（150 mg/kg）和寡甘露糖（200 mg/kg）；第5组饲喂柠檬酸—CA（800 mg/kg）；第6组饲喂寡果糖（150 mg/kg）、寡甘露糖（200 mg/kg）和柠檬酸（800 mg/kg）；第7组饲喂乳糖酶—LA（540 U/ kg）；第8组饲喂乳糖酶—LA（540 U/kg）和柠檬酸（800 mg/kg）；第9组饲喂乳糖酶（540 U/kg）、柠檬酸（800 mg/kg）、寡果糖（150 mg/kg）和寡甘露糖（200 mg/kg）。日粮参照NRC（1998）《猪营养需要》配制，试验猪群饲喂粉料，自由饮水，试验期42 d[7]。

2 结果与分析

2.1 猪LCT基因的多态性及对基因表达的影响通过PCR产物扩增后测序，发现猪LCT基因5'非编码区增强子第-797位出现G或A的单核苷酸多态性；启动子区第-308位为G或C的单核苷酸多态性；启动子区第-301位为A或G的单核苷酸多态性。其中启动子区-308位与-301位是对应的关系，即启动子区-308位为G时，-301位为A；当启动子区-308位为C时，-301位为G，因此构成单倍型GA和CG[6]。

通过双荧光报告系统试验发现，启动子GA和CG相比差异极显著。启动子CG强烈促进基因表达，而GA不能促进基因表达。增强子A，对于启动子GA来说，使启动子GA活性显著增强（P＜0.05）；对于启动子CG来说，却是抑制子，使启动子CG活性极显著降低（P＜0.01）。增强子G，无论是哪一种启动子，均起极显著的抑制作用（P＜0.01）。猪LCT增强子和启动子多态性位点组合形成的单倍型促进基因表达的作用从高到低顺序为：增强子A﹢启动子GA＞增强子A/G﹢启动子CG＞增强子G﹢启动子GA[5-6]。

2.2 LCT基因的多态性与仔猪营养性腹泻的相关分析采用SPSS软件包（version 17.0）的统计模型分析基因型与乳糖不耐受性腹泻的相关关系，结果表明，SNP G-797A的GG基因型、SNP G-308C和SNP A-301G的GAGA基因型分别与地方猪和野猪的乳糖不耐受性腹泻显著相关，其他基因型与野猪/地方猪或引进猪种中乳糖不耐受性腹泻性状相关不显著[6]。

2.3 抗仔猪营养性腹泻饲料添加剂的筛选试验结果表明，所涉及到的4种添加剂具有相当好的协同性和互补性，是单一原料所不能替代的，见表1[7]。从试验数据反映出，造成仔猪腹泻是各种原因综合作用的结果，其中营养性腹泻是主要原因，消化道胃酸分泌不足、微生态平衡不佳是次要原因。4种成分针对仔猪腹泻主次兼顾，因此联合使用获得较好的预防效果。

3 讨论

本研究团队在与以饲养野猪和地方猪为主的养猪企业产学研合作过程中，猪场提出哺乳仔猪腹泻率高。针对这一问题，组织了专家对猪场进行了调查研究，包括猪场的防疫和历史疫病发生情况、泌乳母猪的健康状况、日粮/饲粮配方及饲料原料质量、猪场的生产管理等。与引进猪种相比，未发现引起仔猪腹泻的诱因。受人类乳糖不耐受症的启发，测定了腹泻仔猪的粪便，发现大多数腹泻仔猪粪便中含未被消化吸收的乳糖，由此初步判断仔猪可能由于乳糖酶（LCT）分泌不足而引起营养性腹泻。本课题组通过生产试验和实验室两方面研究确认其原因是小肠中消化乳汁乳糖的LCT缺乏所致，并由此建立了分子标记辅助选择（marker assisted selection,MAS）育种技术，研制出有效的治疗和预防仔猪腹泻的饲料添加剂，获得了2项国家授权发明专利[6-7]，形成抗野猪和地方猪仔猪营养性腹泻的综合配套技术。

表1 添加剂抗地方猪仔猪腹泻的效果分析Table1 The effect of the additives of local pig diarrhea piglets analysis

3.1 仔猪LCT基因的分子标记辅助育种根据2.1和2.2的试验结果，在进行地方猪或野猪的纯繁、以及地方猪或野猪与引进猪种的杂交育种过程中，通过分子标记辅助选择（MAS），淘汰SNP G-797A的GG基因型或SNP G-308C和SNP A-301G的 GAGA基因型或单倍型GAGA个体，可以避免后代出现仔猪营养性腹泻，显著提高猪群仔猪消化乳糖能力，减少由于LCT缺乏引起的仔猪腹泻，降低仔猪死亡率。

3.2 抗腹泻饲料添加剂的应用本研究所筛选的添加剂具有4方面优点：①可以降低仔猪的腹泻率。哺乳和摄入含乳制品仔猪料的野猪及地方猪仔猪腹泻率降低80%以上，健康状况得到显著改善。②可以提高仔猪成活率。由于有效抑制了腹泻，仔猪的采食量增加，疾病发生率显著降低，因而成活率明显提高。③可以提高日增重。由于健康状况得到改善，采食量增加，使仔猪日增重显著提高，不仅提高了仔猪阶段的日增重，也对后期生长肥育阶段的日增重有一定作用。④本饲料添加剂不影响食品安全，无环境污染。所用产品包括安全、高效的酶制剂，来源于天然原料的寡果糖和寡甘露糖，广泛应用于食品生产的柠檬酸，因此本产品不会影响生猪食品安全，也不会带来环境污染，更不会产生耐药性等问题，是安全、高效、环保的饲料添加剂。

3.3 进一步的工作本研究所形成的抗野猪和地方猪仔猪营养性腹泻综合技术如果能够大范围推广应用，可以使野猪和地方猪饲养成本显著降低，保障养猪企业经济效益，有利于扩大野猪和地方猪饲养规模和产业化水平，进一步调动农民利用自然资源饲养野猪和地方猪的积极性，有利于和谐社会的建设和发展。

[1]陈琼，王济民.我国肉类消费现状与未来发展趋势[J].中国食物与营养，2013（6）：43-47.

[2]杨红杰，彭华，王林云.从我国猪肉消费趋势展望地方猪种发展前景[J].中国畜牧杂志，2014，50（16）：6-10.

[3]薛尚军，杨晓奋，刘宏，等.中国地方猪种的肉质特性[J].国外畜牧学-猪与禽，2011，30（2）：92-94.

[4]杜海廷，赵薇，巴彩凤，等.猪乳糖酶基因5'非编码区多态性分析[J].畜牧与兽医，2013，45（8）：35-49.

[5]Du H T,Zhu H Y,Wang J M,et al.Single-nucleotide polymorphisms and activity analysis of the promoter and enhancer of the pig lactase gene[J].Gene,2014,545(1):56-60.

[6]辽宁医学院，苏玉虹，田玉民，杜海廷，等.仔猪乳糖消化性状的LCT基因多态性检测方法及其应用[P].中国：201310339704.3，2013-10-23.

[7]辽宁医学院，田玉民，苏玉虹.抗野猪和地方猪仔猪腹泻的饲料添加剂[P].中国：201110413894.3，2012-04-18.

（编辑：郭雪峰）

Research on Decrease of Nutritional Diarrhea in Boar and Local Piglets

Tian Yumin,Su Yuhong,Wang Yubin,Gao Qun,Zhang Huijun,Wang Tieliang

（Liaoning Medical University,LiaoningJinzhou121001）

High nutritional diarrhea rate in boar and local piglets affected the economic benefits seriously.In this study,the polymorphism loci of pig lactase(LCT)at 5'non-coding enhancer and promoter was detected by PCR and DNA sequencing.And confirmed the regulating genes expression ofLCT polymorphic loci through a experiment with dual luciferase report system.The correlation was significant between the polymorphism of LCT and piglets lactose digestive traits with statistical analysis.Then selected the anti-diarrheal feed additive by feeding trials.The study above formed an integrated technology for controlling nutritional diarrhea in boar and local piglets and laid the foundation for the subsequent application.

Boar Piglet;Local Piglet;Nutritional Diarrhea;Lactase;Feed Additive

S828.4文献标识码：B文章编号：1672-9692(2015)02-0019-04

2015-01-11

田玉民（1962-），男，硕士，教授，硕士生导师，研究方向为饲料资源开发与利用。

辽宁省高等学校优秀人才支持计划一层次项目(LR2013042)