溶剂法提取藕节中鞣质的工艺优化

2015-10-09刘仲华何长征

湖南农业科学 2015年7期

文洋，谭君，谭斌，刘仲华，何长征

（1. 湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙410128； 2. 湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙410000）

我国是莲藕的原产地之一，莲藕资源非常丰富。藕节是指去除须根的莲的干燥根茎节部，无气味，味甘、涩，有较好的凝血、止血及散瘀功效[1-4]。目前，市场上对止血药的需求量很大，除了手术必备以外，日常生活中的磕碰损伤也经常用到此药。而对于那些长期患有血液病的病人更加意义重大，如再生障碍性贫血等，这类患者长期食用藕节汤，能较好地改善病情，有益于疾病的缓解及身体的康复。

研究发现，藕节的止血功效主要与其富含鞣质有关[5-6]。藕节中的鞣质在具备收敛、止血、促凝血[7-8]功效的同时，还有较强的抗氧化作用[9]；也兼具鞣质类物质共同的药理活性，如抑菌、抗病毒、抗肿瘤、护肝益肾等活性[10]。通常，将藕节加工成藕节炭，其止血活性部位的主要成分为3-表白桦脂酸[11-14]。

目前，国内外对于藕节的研究主要集中在其止血特性以及藕节炭的成分测定等方面[15-16]，也有针对藕节中活性成分的提制工艺[17-22]和检测方法[23-25]的相关研究。笔者在单因素试验的基础上，采用正交试验设计对藕节中鞣质的溶剂提取工艺进行优化，利用磷钼钨酸比色法对提取的鞣质进行检测，以确定藕节中鞣质的最佳提取工艺参数，为藕节中鞣质的工业化生产利用打下基础；同时，试验是以日常废弃的藕节为材料提取生物活性物质，实现了废弃物的再利用，创造了较大的经济和社会效益。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器设备 FZ-102 微型植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），Lab Tech 可见- 紫外分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司），SK3300LH 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），HH 数显恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂），电子分析天平（SHIMADZU、AUW 220D），实验室常见的玻璃仪器。

1.1.2 主要试剂没食子酸标准品（纯度为98%，成都曼斯特生物科技有限公司），食用乙醇、甲醇（分析纯，青岛凯祥化工有限公司），钨酸钠、磷钨酸（分析纯，成都科龙化学试剂厂），无水碳酸钠（分析纯，重庆北培精细化工厂），盐酸（分析纯，天津凯诺化工有限公司），溴水、磷酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 磷钼钨酸试剂的配制取钨酸钠100 g、钼酸钠25 g，加水700 m L 使其溶解，加100 m L 盐酸、250 m L 磷酸，加热回流10 h，放冷，再加150 g 硫酸锂、50 m L 水和0.2 m L 溴水，煮沸除去残留的溴（约15 min），冷却，加水稀释至1 000 m L，过滤即得。

1.2.2 供试样制备将新鲜藕节粉碎，准确称取10.0 g 于500 m L 带塞锥形瓶中，在不同工艺下进行提取，待提取液冷却后，抽滤至100 m L 容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，摇匀，静置，即为提取样品。

1.2.3 鞣质含量的检测吸取2.0 m L 提取样品置于25 m L 容量瓶中，加磷钼钨酸试剂1.0 m L，加水10 m L，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以相应的空白试剂做参比，在λmax处测定吸光度值，根据标准曲线的线性方程计算鞣质的含量。

式中：k，表示提取样品的稀释倍数；C，表示鞣质浓度（mg/m L）；V，表示提取样品定容后的溶液体积（m L）；W，表示称取的新鲜藕节的质量（mg）。

1.2.4 最大吸收波长的确定将没食子酸标准品0.5 g 放入棕色容量瓶中，定容至100 m L，再从其中取5 m L 溶液至于50 m L 容量瓶中定容，制得浓度为0.5 mg/m L 的标准储备溶液。精密吸取2.0 m L 标准储备溶液（0.5 mg/m L），置25 m L 棕色量瓶中，加1.0 m L磷钼钨酸试液、10 m L 水，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 m in，以空白试剂做参比，在400～900 nm 波长范围内绘制吸收曲线，根据最大吸收峰来确定最大吸收波长。

1.2.5 标准曲线的绘制参考中国药典2005 版中鞣质含量的测定方法，将没食子酸作为检测藕节中鞣质含量的对照品。分别准确移取1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 m L标准储备溶液（0.5 mg/m L）置于25 m L 棕色容量瓶中，各加磷钼钨酸试液1.0 m L，再分别加10.5、9.0、7.5、6.0、4.5 m L 水，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，得浓度依次为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg/m L 的没食子酸标准使用溶液，摇匀，放置30 m in，以空白试剂做参比，在最大吸收波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 单因素试验（1）料液比。精确称取10.00 g 经处理的藕节样品，分别加入80%的乙醇溶液20、50、80、110、140 m L（即料液比1︰2、1︰5、1︰8、1︰11、1︰14），置于40℃摇床震荡提取2.5 h，抽滤；重复1次；滤液合并于250 m L 容量瓶中定容（1︰14 料液比处理的提取液定容至500 m L），摇匀，再依次从中吸取1.0 m L 提取液稀释至10 m L（定容500 m L 的提取液不稀释），按照1.2.3 的步骤进行检测。（2）乙醇浓度。精确称取10.00 g 经处理后的藕节样品，分别用35%、50%、65%、80%、95%的乙醇溶液进行提取，料液比为1︰11，提取时间为2.5 h，温度为40℃；重复1次；将两次提取的溶液合并，抽滤定容同上，按照1.2.3的步骤进行检测。（3）提取温度。精确称取10.00 g 经处理后的藕节样品，用80%的乙醇溶液分别在30、40、50、60℃温度下提取，料液比为1︰11，提取时间为2.5 h；重复1 次；合并两次的提取液，抽滤定容同上，按照1.2.3 的步骤进行检测。（4）提取时间。精确称取10.00 g 经处理后的藕节样品，用80%的乙醇溶液（料液比为1︰11）在50℃下分别提取1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h；重复1 次；合并两次的提取液，抽滤定容同上，按照1.2.3 的步骤进行检测。（5）提取次数。精确称取10.00 g 经处理后的藕节样品，用80%的乙醇溶液在40℃下提取，料液比为1︰11，提取时间为2.5 h；分别提取1、2、3、4 次，合并各次的提取液，抽滤定容同上，按照1.2.3 的步骤进行检测。

1.2.7 正交试验通过单因素试验明确正交试验的4个考察因素为：A 料液比、B 乙醇浓度、C 提取温度和D 提取时间；各因素的最佳水平范围依次为：料液比1∶8～1∶11、乙醇浓度70%～90%、提取温度50℃附近、提取时间4.5 h 左右。在此基础上进行L9（34）的正交试验设计，其因素水平见表1。各组试验均提取3次，合并提取液抽滤后，稀释10 倍的提取液按1.2.3的步骤进行检测。

表1 L9（34）的因素水平

1.2.8 最佳工艺的验证分别称取10.00g 藕节样品5 份，按照正交试验获得的最佳工艺参数进行提取，稀释后测定鞣质的得率，以验证最佳工艺的准确性和重复性。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长

由400～900 nm 波长范围内的吸收曲线可知，没食子酸标准品的最大吸收波长（λmax）为760 nm，与中国药典2005 版鞣质含量的测定方法中没食子酸的λmax=754 nm 有稍许出入，考虑到760 nm 和754 nm 处没食子酸的吸光度值相差很小，根据实验事实确定没食子酸的λmax为760 nm，并以此作为藕节中鞣质的检测波长。

2.2 标准曲线

由图1 可知，该标准曲线在0.03～0.15 mg/m L 的范围内具有良好的线性关系，其线性系数R 达到0.998 7（R2=0.997 4），符合测定要求。

图1 没食子酸标准品的标准曲线

2.3 单因素试验结果

2.3.1 料液比从图2a 中可以看出，料液比为1︰8和1︰11 的处理，鞣质的得率较高，但当料液比为1︰14 时，鞣质的得率反而降低了，可能是因为藕节中的鞣质降解了（鞣质的得率是占10 g 新鲜藕节的百分比，因而不存在因为溶剂量加大而产生稀释作用。鞣质本身属于结构复杂的酚类化合物，在空气中易于氧化，或者水解）。而根据图中趋势可知，在1︰8 和1︰11 的料液比之间应存在曲线的最高点，故在正交试验设计中将该因素的水平范围定为1︰8～1︰11 之间。

2.3.2 乙醇浓度由图2 b 可以看出，在乙醇浓度为35%～80%范围内时，鞣质的得率随着乙醇浓度的增加而升高，但当乙醇浓度高于80%时，鞣质的得率随着乙醇浓度的增加而降低，故在正交试验中，选择70%～90%的乙醇浓度作为该因素的考察范围。

2.3.3 提取温度由图2 c 可知，随着提取温度的升高，得率逐渐升高，当提取温度达50℃时，得率升高的趋势趋于平缓，50℃与60℃下的得率未见明显差别。而有关资料表明，在鞣质的提取过程中，温度过高会使鞣质分解为其他物质，这些物质在760 nm 波长处仍有较大吸收峰，从而干扰试验结果。因此，正交试验中设计的提取温度范围为40～50℃。

2.3.4 提取时间由图2 d 可知，随着提取时间的延长，藕节中鞣质的得率表现出先增加后下降的趋势；在提取4.5 h 时，藕节中鞣质的得率最高。这可能是由于藕节中的鞣质不稳定，提取时间过长，藕节中的鞣质被降解了。因此，在设计正交试验中，提取时间范围设置为4.0～5.0 h。

2.3.5 提取次数不同提取次数的测定结果显示，仅提取1 次时，藕节中的鞣质提取不够充分，得率仅为0.86%；提取2 次时，得率增加为1.17%；提取3 次时，得率增加至1.33%；提取4 次时，得率没有明显的改善，为1.35%。从经济实惠、生态环保的角度考虑，选择3 次为最佳提取次数。

图2 不同提取条件下藕节中鞣质的得率

2.4 正交试验结果

由表2 可知，采用乙醇提取藕节中的鞣质最佳工艺参数为A2B2C3D1（试验5），即料液比1︰10、乙醇浓度80%、提取温度50℃、提取时间4.0 h，得率为1.289 4%。由极差值可知，各因素对提取效果影响的大小顺序为：料液比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间，即料液比为最主要的影响因素，乙醇浓度次之，其中提取时间对藕节中鞣质的得率影响较小。由表3 的方差分析结果可知，料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间对试验结果的影响均没有极显著性意义。

表2 正交试验结果

表3 正交试验结果的方差分析

2.5 最佳工艺验证

按正交试验得出的最佳工艺对藕节中的鞣质进行重复提取，鞣质的得率分别为1.320 4%、1.299 0%、1.283 8%、1.390 4%、1.180 6%，重复间的相对标准偏差（RSD）为5.85%，从而证实该方法精密度高、重复性好，具有良好的稳定性。

3 结论与讨论

生产上鞣质的高效提取需要综合考虑安全、成本和环保3个方面的因素，而乙醇作为食品工业常用的有机溶剂，廉价易得，提取效果显著，相对安全，易于挥发脱除，便于回收循环利用，故研究中选取乙醇作为提取溶剂中的有机相，结合水的配比对藕节进行萃取，分别考察料液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度和提取次数等单因素对得率的影响。

正交试验的因素增加1个，其不同因素和水平组合的试验次数将显著增加。例如：4 因素3 水平的正交设计需要做9 次试验L9（34），而5 因素4 水平的正交设计需要做16 次试验L16（45），工作量显著增加。而从单因素试验结果来看，提取次数与其他的各因素之间没有明显的交互关系，故确定提取次数为3 次后，对其他4个因素进行3 水平的正交试验设计，以确定藕节中鞣质的最佳提取工艺参数。

该研究在利用磷钼钨酸/干酪素法测定藕节中鞣质含量的基础上，通过单因素试验和正交试验从料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间、提取次数等方面对藕节中鞣质类物质的乙醇提取工艺进行了优化。结果表明，在料液比1︰10、乙醇浓度80%、提取温度50℃、提取时间4.0 h 的条件下，藕节中鞣质的得率平均可达1.294 8%，最高得率可达1.390 4%。同时，该工艺操作简单方便，成本较低，适合工业化生产，为藕节中鞣质类化合物的进一步开发利用奠定了基础。

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