尤丹瑜，罗丛伟，万建新

慢性肾脏疾病中，趋化因子如单核趋化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）在 肾 组织中的表达增加常常伴随着肾脏纤维化的进展［1］，尿液中的MCP－1可以早期预测肾脏疾病［2］。补体C3片段C3a受体（compleneut 3areceptor，C3aR）是一个55kDa大小的蛋白质，主要分布于人肾小管上皮细胞、肾小囊脏层和壁层上皮细胞［3］。C3a－C3aR可以介导肾小管上皮向间充质转分化［4］；并可能通过激活TGF－β／Smad3信号通路促进糖尿病肾病模型肾脏纤维化［5］。尿酸（uric acid，UA）已经被证明可以有效地诱导肾小管上皮细胞表达MCP－1［6］。笔者拟将 UA作为诱导剂诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞（human renal proximal tubular epithelial cell line，HK－2）表达MCP－1，并观察C3在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HK－2（中国典型培养物保藏中心细胞库，细胞编号3142C0001000000136）；DMEM／F12培养基（批号：NAB1336，美国 Hyclone公司）；Trizol（批号：S0175111，美国Invitrogen 公司）；cDNA第一链合成试剂盒及RT－Q－PCR试剂盒（批号：00246705，BK1001，日本 TaKaRa公司）；ELISA试剂盒（批号：EK0441，武汉博士德公司）；UA（批号：156158，美国 Sigma－Aldrich公司）；C3a（批号：H1608，美 国 Santa Cruz 公 司）；X－tremeGENE siRNA转染试剂盒（批号：04476115001，瑞士Roche公司）；C3aR阻断剂SB290157（批号：H1457，美国Santa Cruz公司）；双链小干扰 RNA（批号：SL01100，美国Sigma－Aldrich公司）。

1.2 方法

1.2.1 HK－2 培养、传代 HK－2 细胞培养于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱，培养液为DMEM／F12培养基添加10%磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）。每隔48h更换培养基1次，待细胞生长至80%～90%融合，即可传代。传代时，吸去培养基，用PBS清洗1次，加入0.25%胰蛋白酶0.8mL后于倒置显微镜下观察，当视野中绝大多数细胞开始皱缩、彼此分离时，弃去胰酶，加入适量培养基并用移液管轻柔吹打瓶底，使细胞脱落形成悬液，按1∶3分装接种，移入新的培养瓶，补足培养基。

1.2.2 UA诱导 将生长至80%～90%的细胞按照以上步骤消化并用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM／F12培养基重悬后，吹打混匀，经细胞计数板计数，将细胞浓度调整为0.5×105mL－1。将细胞悬液沿每孔孔壁同侧匀速加入6孔板中，每孔加液量为2.5mL。正常换液，待细胞生长至70%融合时，弃去原培养基并用PBS清洗2遍，加入无血清DMEM／F12培养基继续培养24h使细胞同步化。弃去原培养基，分别于各孔中加入0，75，150，300，600μmol／L的 UA－DMEM／F12培养基培养24h，根据逆转录PCR（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）的结果选取最适浓度。在细胞同步化后0h（48h组）、24h（24h 组）、36h（12h 组）、42h（6h 组）时加 入UA－DMEM／F12培养基，并同时更新其他各组及空白对照组（0h组）的DMEM／F12培养基（或UADMEM／F12培养基），于同步化后48h结束干预，通过RT－PCR法选取最合适的干预时间。

1.2.3 C3小干扰RNA转染 按前述细胞种板步骤进行细胞消化、计数及种板，正常换液待细胞生长至50%融合时，弃去原培养基并用PBS清洗2遍后在各孔中加入1mL无血清DMEM／F12培养基。将3μg siRNA用300μL无血清培养基稀释混匀，另取转染试剂15μL用无血清培养基300μL稀释并吹打混匀后缓慢加入到已稀释好的siRNA液体中，轻柔吹打混匀后于15～25℃下静置15～20min。在6孔板中每孔加入无血清DMEM／F12 900μL，后将转染试剂与siRNA的混合液加入到6孔板中，每孔加100μL，加液完毕混匀。于转染后5h弃去原培养基，用PBS清洗1遍后加入含10%FBS的DMEM／F12，继续培养24h后更换为无血清培养基进行同步化，24h后进行UA干预。小干扰RNA序列如下：

1.2.4 RT－PCR 干预结束后用 Trizol液提取细胞总RNA，用DEPC处理过的纯水溶解RNA。采用紫外分光光度仪测定RNA含量。按照TaKaRa公司 PrimeScriptTMRT reagent Kit说明书将 RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增反应，序列如下：

PCR 反应条件如下：β－actin：94 ℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸30s，共28个循环。MCP－1：94℃变性30s→61℃退火30s→72℃延伸30s，共30个循环。取PCR反应产物5mL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳40min，于紫外灯下拍照，采用Tanon图像识别软件进行分析，以内参β－actin光密度值校正，进行PCR产物的半定量分析，比值表示其相对含量。

1.2.5 实时荧光定量 PCR（real－time quantitative PCR，Q－PCR） 按照 TaKaRa 公 司 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行。反应条件：采用ABI PRISM7500Fast型荧光 PCR 仪及 SYBR Green PCR二步法进行PCR反应。预变性：95℃预变性30s；二步法扩增：95℃变性5s，60℃34s，循环40次。反应结束后荧光定量分析软件自动绘制扩增动力曲线和溶解曲线，结果用CT值表示，即在指数增长初期，荧光信号跨越阈值时的循环数。采用比较CT值相对定量方法算出各待测样品的相对初始拷贝数即RQ值。各目的基因和内参照基因序列如下：

1.3 统计学处理 数据均以均数±标准差表示，采用SPSS 11.5软件分析，诱导实验中各组与对照组间比较采用两独立样本t检验；其余各组间比较采用单因素方差分析（除有特殊说明以外），之后的两两比较采用SNK检验［不满足方差齐性者（P＜0.1）采用Dunnett’s T3检验］，P＜0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度UA在不同时间对 MCP－1mRNA表达的影响

2.1.1 不同浓度 UA对 MCP－1mRNA表达的影响 RT－PCR结果显示：培养于DMEM／F12培养基中的 HK－2细胞可表达 MCP－1mRNA，经75，150，300，600μmol／L UA诱导24h后可见：不同浓度UA对 MCP－1mRNA表达的影响并不相同，其中150μmol／L UA 可使 MCP－1mRNA 表达明显增加（图1）。

图1 不同浓度UA对MCP－1mRNA表达的影响Fig1 The expression of MCP－1mRNA induced by UA of different concentrations

2.1.2 150μmol／L UA 在不同时间对 MCP－1 mRNA转录的影响 RT－PCR结果显示：培养于DMEM／F12培养基中的 HK－2细胞表达 MCP－1 mRNA，经6，12，24，48hUA 诱导后，可见 MCP－1 mRNA在6h和12h时表达最明显，此后随着时间延长，UA表达逐渐减少（图2）。选取12h作为后续试验的UA诱导时间。

图2 150μmol／L UA 在不同时间对 MCP－1 mRNA表达的影响Fig2 The expression of MCP－1mRNA induced by 150μmol／L UA in different periods

2.2 C3siRNA干预对C3及 MCP－1mRNA表达的影响 Q－PCR法检测C3siRNA转染对于150μmol／L UA诱导12h的各组 HK－2细胞C3、MCP－1表达水平的影响。该结果示：与单纯UA干预组比较，Control siRNA 转染组的 C3、MCP－1 mRNA表达无明显改变；而C3siRNA转染组的C3、MCP－1mRNA 表达水平较 Control siRNA 转染组明显下降（图3）。

图3 C3siRNA干预对C3和 MCP－1mRNA表达的影响Fig3 The expression of C3and MCP－1 mRNA influenced by C3siRNA

2.3 C3aR阻断剂SB290157对C3、MCP－1、C3aR mRNA表达的影响 经Q－PCR法检测发现，150μmol／L UA干预12h可显著上调 HK－2细胞C3、MCP－1、C3aR mRNA的表达，终浓度为1μmol／L的C3aR阻断剂SB290157预处理显著抑制了UA诱导的 MCP－1mRNA表达（图4）。

图4 C3aR 阻断剂对 C3、MCP－1和 C3aR mRNA表达的影响Fig4 The expression of C3，MCP－1and C3aR mRNA influenced by SB290157

2.4 C3a联合UA干预对 MCP－1mRNA表达的影响 为进一步证明C3aR激活与HK－2细胞MCP－1表达的关系，采用100nmol／L C3a预处理不同干预条件下的细胞，并使用Q－PCR检测干预后的 MCP－1mRNA表达水平。结果显示：C3a单独干预8h仅微弱上调HK－2细胞 MCP－1mRNA的转录，但当其与150μmol／L UA共同干预相同时间则显著上调了UA诱导的 MCP－1mRNA转录（图5）。

图5 C3a联合UA干预对MCP－1mRNA表达的影响Fig5 The expression of MCP－1mRNA influenced by C3aand UA

3 讨 论

UA与慢性肾脏病关系密切，流行病学研究证明，血清UA水平是预测肾脏疾病进展的一个重要因素［7－8］。升高的血UA水平与系统性炎症反应有关，UA刺激大鼠的血管平滑肌细胞，可激活丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK及ERK1／2）和环氧合酶－2（cyclol－oxygenase－2，COX－2），使得 C反应蛋白（C－reaction protein，CRP）及 MCP－1的表达显著增加［9］。而MCP－1为趋化因子家族成员，正常人近曲小管上皮细胞HK－2可表达少量 MCP－1，并且可在某些细胞因子、CD40L、蛋白等诱导下高表达MCP－1［10］。在人的肾脏活组织标本中，MCP－1的表达水平与肾脏中巨噬细胞的浸润水平明显相关，尿液中MCP－1的水平则与肾脏疾病的活动度相关联［11－12］。该研究也提示了 UA 对 MCP－1mRNA 有上调作用。

而UA如何上调MCP－1mRNA表达，笔者认为其机制可能与UA激活C3或C3aR有关。本研究中，C3siRNA转染或C3aR阻断能够抑制被UA上调的 MCP－1mRNA表达；C3a显著增强了UA对MCP－1mRNA的诱导作用。首先，HK－2细胞可以在一定浓度的UA诱导下呈时间依赖性地过表达MCP－1mRNA，并且这种诱导可被C3aR阻断剂SB290157显著抑制。C3aR阻断剂SB290157为一种选择性、高亲和力并竞争性结合C3aR的非肽类小分子三氟乙酸盐，已在C3a－C3aR的相关研究中被运用于 HK－2细胞系，1μmol／L SB290157可成功阻断C3a诱导的HK－2细胞表型转化［5］。另外，单独使用C3a进行干预时，MCP－1mRNA表达虽有上升，但当C3a与UA共同作用于HK－2细胞时，MCP－1mRNA表达明显增加。由此，笔者推测C3a－C3aR的相互作用为 UA介导的 HK－2细胞MCP－1mRNA的表达起到类似于信号放大的作用。在UA介导的 MCP－1mRNA表达过程中，可能涉及另一条未知信号通路的激活，并且该通路的激活是C3a促进HK－2细胞MCP－1mRNA表达的必要条件。为进一步探究C3aR激活在 MCP－1 mRNA表达中所扮演的角色，笔者需要对可能涉及到的细胞内信号机制进一步研究。目前关于C3aR激活在MCP－1生成中可能涉及到的细胞内信号机制包括如下几个方面：（1）C3aR羧基端集簇Ⅱ内PDZ结构域的磷酸化与细胞内核因子－κB信号通路的激活［13］；（2）补体系统的激活与不同丝裂原活化蛋白激酶信号通路的活化［14］；（3）肾素－血管紧张素系统激活在C3a介导的 MCP－1产生中的作用［15－17］。这也为笔者今后进一步的研究提供方向。

由于MCP－1等因子所介导的炎性细胞向小管间质区的浸润是肾脏纤维化进展的重要促进因素，抑制C3的激活或阻断C3a－C3aR相互作用可能成为防止肾纤维化进展的又一重要手段。

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