詹 暶，林 燕，陈梅芳，李艳芬，闫福华

龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF）是通过龈沟上皮和结合上皮从牙龈结缔组织渗入到龈沟内的液体，含有多种可以反映牙周的健康和疾病状态的物质，通过GCF的收集和分析可能以位点特异性的方式来评价和监测牙周组织的病理生理状态［1］。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）能降解细胞外基质的溶解酶，是牙周组织破坏的主要蛋白溶解酶，主要由炎症渗出细胞如中性多型核白细胞和在炎症刺激下的成纤维细胞及其他牙周膜细胞分泌［2］。有研究显示，慢性牙周炎患者的GCF中，MMP－8占总胶原酶蛋白的80%；在活动性牙周疾病位点的GCF中含量增高［3－4］。牙周非手术治疗可以降低近50%的 MMP－8水平和活性［5］。MMP的含量和活性由其抑制剂（tissue inhibitiors of metalloproteinase，TIMP）调 节，其 中TIMP－1的活性范围最广泛，能与大部分 MMP结合［6］。因此，检测 GCF中 MMP－8和 TIMP－1的水平，可能有助于牙周病的诊断及判断疾病的进程。本实验旨在探讨牙周非手术治疗对重度牙周炎患牙GCF中的 MMP－8和 TIMP－1水平的影响，并对MMP－8和TIMP－1与各临床指标进行相关分析，以期为MMP－8和TIMP－1作为GCF中牙周健康或疾病状态的生物标记分子提供临床试验基础。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2013年7－10月就诊的慢性牙周炎患者7例，男性4例，女性3例，年龄中位数38岁（20～60岁）。纳入标准：（1）全身健康，无系统性疾病（例如糖尿病、骨质疏松和免疫系统紊乱性疾病等）；（2）至少6月内未使用过抗生素或3月内未服用过非甾体类抗炎药者；（3）1年内无牙周治疗史。排除标准：（1）妊娠或哺乳期妇女；（2）吸烟患者；（3）口内余留牙＜20颗；（4）正畸治疗史。分别从每位受检者口腔中选取2～4颗重度牙周炎患牙（牙周袋≥6mm，附着丧失≥5mm，X线片显示牙槽骨吸收超过根长的1／2甚至达2／3）作为试验牙，共20颗。

1.2 方法

1.2.1 材料和仪器 滤纸（Whatman?1号，英国Whatman公司）；旋涡混合器（HQ－60，北方同正生物技术发展公司）；高速离心机（LABOFUGE 400R，德国贺利氏公司）；MMP－8、TIMP－1试剂盒（福州硕博生物技术有限公司），试剂盒测试敏感度均为1.0ng／mL，检测值范围0～400ng／mL；刮治器（Gracey，美国 Hu－Friedy公司）；洁牙机（Piezon 700型，瑞士EMS公司）。

1.2.2 实验内容

1.2.2.1 GCF的采集 将1.5mL的Eppendorf管消毒备用，Whatman?1号滤纸准确裁成2mm×8mm的滤纸条，在超净台内紫外线消毒30min，将滤纸条翻面后再消毒30min后分装，每2张滤纸条放入一个Eppendorf管中并编号，电子天平上称质量，记录结果，密封备用。用上述消毒备用的Whatman?1号滤纸条插入实验牙颊侧近中或远中牙周袋内，直至遇到轻微阻力为止，30s后取出（若滤纸条上带血，则弃之不要，另选其他牙齿）。将收集有GCF的滤纸条放置于1.5mL的Eppendorf管中，2min后用同样方法在同一部位再次收集GCF，将滤纸条放入同一Eppendorf管中，精密电子天平称质量，记录结果，并与收集GCF前的质量相减，计算出所收集的GCF质量，根据其比重关系（约1mg／μL）算出所得到的GCF体积，记为该牙的GCF量。称质量后将标本放于－20℃冰箱保存，待样本采集结束后同时检测MMP－8和TIMP－1含量。

1.2.2.2 ELISA法检测GCF中的MMP－8 和TIMP－1的含量 将治疗前后收集到的所有样本在同一日测试。实验前将保存于－20℃的样本于室温下一次性解冻，加入250μL PBS缓冲液（pH＝7.4），用旋涡混合器恒温振荡60min。使用高速离心机在4℃条件下以10 000r／min离心10min，去除细菌、细胞残渣等杂质。取上清液分装到另外2个干净的微离心管中，用MMP－8、TIMP－1试剂盒测定其中MMP－8和TIMP－1的含量。

1.2.2.3 操作步骤 采集GCF进行牙周检查，记录菌斑指数（plaque index，PLI）、牙周袋深度（probing depth，PD）、出血指数（bleeding index，BI）、附着丧失（attachment loss，AL）。检查完毕后，进行牙周非手术治疗，包括口腔卫生指导＋龈上洁治＋龈下刮治＋根面平整术。1月后按前述方法对所选牙重复采集GCF，并记录各项牙周临床指标。

1.3 统计学处理 治疗前后的MMP－8和TIMP－1以及临床指标以±s表示。统计分析治疗前后数值的差异时，当差值符合正态性分布时采用配对t检验，不符合正态性分布时采用Wilcoxon符号秩检验。MMP－8和TIMP－1与临床指标的相关分析中，若资料符合正态性分布则采用Pearson相关分析，若不符合正态性分布则采用Spearman相关检验。P＜0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1 牙周非手术治疗对各项临床指标及 MMP－8、TIMP－1的影响 牙周非手术治疗可以显著改善各项临床指标（表1）。GCF中 MMP－8和TIMP－1水平在治疗前后无显著变化（表1）。

表1 牙周非手术治疗对各项临床指标及 MMP－8、TIMP－1的影响Tab1 Clinical indices and the effects of MMP－8and TIMP－1before and after the periodontal nonsurgical treatment

2.2 MMP－8、TIMP－1水平与临床指标在治疗前后的相关分析 除TIMP－1与治疗后PLI呈正相关关系外（P＜0.05），MMP－8和 TIMP－1与其他临床指标均无显著相关性（表2）。

表2 MMP－8、TIMP－1水平与临床指标在治疗前后的相关分析Tab2 The relationship between the levels of MMP－8and TIMP－1and different periodontal indices before and after the nonsurgical treatment

3 讨 论

牙周非手术治疗是最基本的牙周治疗手段，已有充分证据表明，牙周非手术治疗能获得良好的疗效，特别是在临床指标的改变方面［7－8］。本研究结果显示，牙周非手术治疗后，各项临床指标（PD、AL、BI、PLI和GCF的量）均有显著降低，说明牙周组织的炎症状况获得改善，与以往的研究结果一致［7－8］。

有研究认为，MMP－8与牙周的炎症密切相关，牙周非手术治疗能显著减少 MMP－8的分泌［9－11］。但本实验GCF中，MMP－8的水平在治疗前后无明显变化，与Mouzakiti等的研究结果相似［12］。究其原因可能是：（1）与牙周炎的严重程度有关。在非手术治疗前后MMP－8水平有显著下降的实验中，治疗前 PD 为 （6.4±0.6），（4.358±0.684），（6.3±0.68）mm，经治疗4周后下降到（4.8±0.7），（2.95±0.32），（5.04±1.35）mm，提示牙周炎症得到良好的控制［9－11］。本试验选取的重度慢性牙周炎患牙，治疗前后的PD为（7.3±1.38）和（6.25±1.92）mm，与 Mouzakiti 等的结果（7.1±2.1）和（5.6±1.7）mm 相似［9］。Morrison等纵向观察了牙周非手术治疗及改良Widman翻瓣术等手术治疗后5年的临床效果，结果显示，对于深袋（PD≥7mm）部位，牙周非手术治疗的疗效有限，还需考虑进一步的手术治疗［13］。因此，提示本实验中非手术治疗虽然改善了各项临床指标的数值，但实际的临床炎症并未得到有效控制，所以MMP－8的水平未改变。（2）与治疗后的观察时间有关。Kinane等发现，MMP－8的水平在非手术治疗4周后无明显改变，但3月后却有显著下降［5］。（3）与检测的内容有关。本研究检测的是GCF中 MMP－8的含量，既往也有研究认为，比起MMP－8的含量，MMP－8活性检测更能区别牙周炎、牙龈炎还是牙周健康位点［14］。有研究采用ELISA法检测GCF中MMP－8的水平，并以Ⅰ型胶原为底物检测MMP－8的溶胶原活性，结果显示，即使经过有效的牙周治疗，牙周感染位点 MMP－8水平和溶胶原活性仍较高，且变化范围较大［15］。关于 GCF中MMP－8的水平与牙周临床指标的相关分析显示，两者并无相关性，与既往的研究结果一致［9，12］。

TIMP是 MMP的抑制剂，关于TIMP－1的研究结果大相庭径。Mouzakiti等发现，牙周非手术治疗后，TIMP－1水平显著升高［12］。笔者认为，这可能是组织愈合过程中发生的改变，以试图逆转MMP造成的组织破坏。王丽琴等却发现，非手术治疗能显著减少TIMP－1的分泌，原因是炎症造成 MMP－8水平增高，使TIMP－1反应性增高，临床治疗后，随着 MMP－8水平的下降，TIMP－1 亦相应 减少［10］。本研究结果显示，治疗前后GCF中TIMP－1的水平并无显著性差异，与Marcaccini等的研究结果相似，可能是因重度炎症时，非手术治疗的疗效有限，MMP－8没有改变，TIMP－1也相应没有变化［16］。相关性分析发现，TIMP－1与治疗后的PLI呈正相关关系，与其他指标无相关性，这与其他学者的研究结果都不同［9－12，16］，可能是因治疗后菌斑控制不佳会使炎症控制不佳或复发，导致机体反应性增加TIMP－1，以对抗MMP造成的破坏。但上述研究在设计上存在差异，如样本收集的时间、牙周炎的严重程度以及样本的检测方法等，使结果难以进行直接的比较，因此还需更完善的研究以阐明TIMP－1与牙周炎的关系。

综上所述，牙周非手术治疗虽然短期内可以改善重度牙周炎（PD≥7mm）的临床症状，但不能消除牙周组织内的炎症和破坏。因此，有限的临床疗效不足以改变MMP－8及TIMP－1的分泌。今后的研究可从加大样本量，延长观察期，完善牙周治疗，如增加牙周手术治疗后的检测等方面来明确MMP－8和TIMP－1与牙周健康或疾病状态间的关系。

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