何德喜，童 岚，何汝畅，李晓琴，潘海峰，靳 阳

（1.成武县人民医院，山东 成武274200；2.吉林大学第一医院，吉林 长春130021；3.济宁医学院附属医院，山东 济宁272000；4.一汽总医院，吉林 长春130011；5.济宁市第一人民医院，山东 济宁272011）

骨肉瘤（Osteosarcoma）也称成骨肉瘤，是常见的骨原发性恶性肿瘤，具有恶性程度高、侵袭性强、易复发转移等特点［1］。随着新辅助化疗、手术、术后化疗的开展，骨肉瘤5年生存率提高到近80%，但仍有半数以上的患者死于骨肉瘤的转移和复发［2］。有效控制骨肉瘤细胞的转移对延长患者生存期有着深远意义。

PI3K/AKT细胞信号转导通路在肿瘤的发生、增殖、迁移、耐药等生物过程中发挥着重要作用。AKT是PI3K下游的靶蛋白，是信号转导途径中的关键蛋白激酶，在多种肿瘤中如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和口腔鳞癌等肿瘤细胞中呈过表达［3］。活化的Akt通过影响下游多种效应分子的活化状态而发挥作用。因此AKT成为研究肿瘤生物学行为的重要靶点，MK－2206是一种强效的，高特异性及非ATP竞争结合的Akt变构抑制剂［4］，本研究以骨肉瘤细胞 MG63为实验材料，检测MK－2206对骨肉瘤细胞增殖及侵袭能力的影响，为骨肉瘤的药物治疗提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞株MG－63购自上海中科院细胞库，生长于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，待细胞长至体积比约90%时，进行后续试验。

1.1.2 主 要 试 剂 MK－2206 购 自 美 国 Selleck Chemicals公司；RT－PCR 反应试剂盒和 DNA Marker购自日本Takara公司；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；鼠抗β－actin、兔抗p－Akt、兔抗 MMP9、兔抗 TIMP、兔抗 VEGF多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗兔或小鼠IgG购自北京博奥森公司。

1.1.3 分组 未经处理的细胞为空白对照组、加入等量DMSO的细胞为溶媒对照组，加入 MK－2206的细胞为实验组。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定细胞增殖抑制率 取对数生长期细胞，制备浓度为4×105/L的细胞悬液，接种于无菌96孔培养板，每孔200μl，于37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中培养12h。实验组分别给予1、2.5、5、10、20μM/L的 MK－2206。每组的每个浓度下设6个复孔，培养24h后，每孔加入20μl的噻唑蓝（MTT 5g/L）。孵育4h后，吸弃各孔培养液，每孔加入DMSO150μl。微振荡10min后，于酶标仪波长490nm处测吸光度（A）值。以上各组实验重复6次。细胞增殖抑制率（%）＝（1－实验组A值/对照组A值）×100%。

1.2.2 RT－PCR法检测 mRNA 取处于对数生长期的细胞按2×106/孔的细胞数接种于6孔板内，实验组给予10μM/L的 MK－2206，培养24h。Trizol裂解各组MG63细胞提取总RNA，半定量RTPCR法检测各组细胞中的CyclinD1、CDk4、VEGF、内参照GAPDH，引物见表1。

1.2.3 Western Blot法检测蛋白表达 将各组细胞用冷PBS冲洗3次，吸净PBS液体。在培养瓶中加入400μl蛋白裂解液及4μl苯甲基磺酰氟（PMSF）提取蛋白，喹啉二甲酸二钠（BCA）法蛋白定量。加入上样缓冲液，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）电泳，每孔蛋白含量约为30 μg。将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，丽春红染色，含5% 脱脂奶粉的Tris盐酸缓冲液（TBST）4℃封闭过夜。在PVDF膜上加入1∶250稀释的兔抗p－Akt、MMP9、VEGF抗体，1∶500兔抗β－actin杂交2h，PBS洗膜；加入1∶1 000稀释的羊抗兔二抗，37℃ 孵育2h，增强化学发光法（ECL）显色。观察各条带深浅变化并加以分析，β－actin作内参照。测量条带灰度值，与β－actin比值作为蛋白相对表达量。

表1 引物序列表

1.3 统计学处理

数据以均数± 标准差（mean±SD）表示，采用SPSS 13.0统计软件分析。组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MK－2206对骨肉瘤细胞MG63增殖的影响

MTT法检测结果显示骨肉瘤细胞MG63在不同浓度MK－2206作用24h后，细胞增值率均受到了抑制。1，2.5，5，10，20μM/L浓度时均明显抑制了骨肉瘤细胞MG63的增殖，抑制率分别为7.98±4.24%，15.07±3.55%，29.36±3.15%，47.78±3.94%，65.32±3.25%，P＜0.05，并且呈剂量依赖性（见图1）。10μM/L MK－2206组的增殖抑制率最接近IC50，后续实验选用10μM/L浓度。

图1 MK－2206抑制了骨肉瘤细胞MG63的增殖

2.2 MK－2206有效阻断了Akt的磷酸化

10μM/L MK－2206 作 用 MG63 细 胞 24h，Western－blot法检测各组细胞中的p－Akt，实验组中的p－Akt水平较对照组明显降低，测得灰度值MK－2206组0.45±0.05，P＜0.01。

图2 MK－2206阻断AKT磷酸化

2.3 RT－PCR法检测增殖相关基因的表达

RT－PCR结果显示 MK－2206可以抑制 MG63细胞内增殖相关基因CD1、CDK4的表达，同时下调了 VEGF的表达。MK－2206组CyclinD1mRNA 0.87±0.05，P＜0.01；CDk4mRNA 1.04±0.04，P＜0.01和 VEGF mRNA 0.96±0.01，P＜0.01表达量显著降低。

图3 MK－2206对骨肉瘤细胞MG63增殖相关基因的影响

2.4 Western Blot法检测侵袭相关基因的表达

Western Blot结果显示实验组细胞中侵袭相关基因 MMP9表达下降，VEGF表达也下降，MMP9 0.57±0.05，VEGF 0.81±0.06，P＜0.01，说明了MK－2206对骨肉瘤细胞有抑制侵袭的作用。

图4 MK－2206抑制骨肉瘤细胞MG63侵袭

3 讨论

骨肉瘤好发于青少年，发病率居原发骨恶性肿瘤的第1位，在截肢术作为主要治疗方案的年代，其5年生存率不及20%，预后极差。随着手术操作技术的提高、术前术后放化疗、新化疗药物的研发、新辅助化疗联合保肢治疗的发展，不仅使患者避免了截肢带来的残疾，而且将5年生存率提高到80%，明显延长了骨肉瘤的生存期［5］。肿瘤复发和转移仍然是骨肉瘤患者死亡的主要原因，有效抑制肿瘤侵袭对防治骨肉瘤复发、转移、改善预后具有重要意义。

PI3K/AKT细胞信号转达通路在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，PI3K通过磷酸化激活AKT调控下游基因，诱导系列级联反应对肿瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭、耐药等生物过程发挥重要作用［3］。AKT是PI3K/AKT通路的关键靶点，本实验采用高选择性AKT抑制剂MK－2206阻断AKT磷酸化激活，研究骨肉瘤细胞GM63增殖及侵袭能力的变化。Western blot结果表明 MK－2206可以有效阻断AKT的磷酸化，并且通过MTT实验发现，MK－2206抑制骨肉瘤细胞 MG63的增殖，随着MK－2206的浓度升高，抑制作用愈加明显，具有剂量依赖特点。细胞周期蛋白CyclinD1是细胞周期调节因子之一，CyclinD1表达增高意味着肿瘤细胞增值能力增强，其可阻断相应的CDks，消除Rb蛋白对细胞周期的阻滞作用［6］。本实验通过RT－PCR检测到MK－2206组细胞的CyclinD1、CDk4表达降低，说明骨肉瘤细胞MG63增殖能力下降。血管内皮生长因子VEGF诱导肿瘤内新生血管形成，提供肿瘤细胞生长需要的营养［7，8］。同时VEGF还具有增强血管内皮通透性的作用，促进肿瘤细胞侵袭。本研究分别检测骨肉瘤细胞MG63中VEGF mRNA和蛋白水平的变化，实验组表现出了VEGF表达的明显减少，说明MK－2206对骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力起到了抑制作用。Western blot还检测到实验组MG63细胞中金属基质蛋白酶MMP9的下调表达。MMP9是肿瘤细胞分解破坏基底膜的主要蛋白酶之一，在肿瘤细胞的侵袭过程中发挥着关键作用，MMP9的下调表达说明肿瘤细胞侵袭能力的降低。

综上所述，AKT抑制剂 MK－2206通过阻断AKT磷酸化阻断了PI3K/AKT细胞通路对MG63骨肉瘤细胞的影响，下调表达了增殖相关基因CyclinD1、CDk4、VEGF和侵袭相关基因 MMP9，说明MK－2206可以有效抑制骨肉瘤细胞 MG63的增殖和侵袭能力，为骨肉瘤的新辅助化疗提供了新的理论依据。

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