史红星，张华潭，张静宜，李春花

(1.衡水市中医医院，河北 衡水 053000；2.河北医科大学 研究生学院，河北 石家庄 050017；3.河北中医学院 药剂教研室，河北 石家庄 050091)

·中药工业·

多指标综合评价优选葶苈生脉方中丹参、红花提取工艺△

史红星1，张华潭2，张静宜2，李春花3*

(1.衡水市中医医院，河北 衡水 053000；2.河北医科大学 研究生学院，河北 石家庄 050017；3.河北中医学院 药剂教研室，河北 石家庄 050091)

目的：优选葶苈生脉方中丹参、红花的提取工艺。方法：以丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、羟基红花黄色素A为综合评价指标，通过正交试验设计考察乙醇浓度、料液比、提取次数和提取时间对提取工艺的影响；采用高效液相色谱法测定4种成分的含量。结果：最优提取工艺为加10倍量60%乙醇超声提取4次，每次50 min。结论：优选的提取工艺稳定、可行。

丹参；红花；提取工艺；正交试验；丹参酮I；丹参酮ⅡA；隐丹参酮；羟基红花黄色素

葶苈生脉方由葶苈子、丹参、红花、红参、黄芪等组成，是全国名老中医邢月朋治疗气虚血瘀、阳虚水停型充血性心力衰竭(CHF)的经验方。经临床验证能有效缓解症状，改善生活质量，减少住院时间。“邢月朋益气活血、温阳利水法”治疗慢性心力衰竭诊疗方案被列为国家“十一五”科技支撑计划项目。方中丹参与红花所含成分不稳定，长时间受热易分解[1-2]，为将葶苈生脉方开发为现代制剂，笔者探索适于方中丹参、红花工业生产的工艺参数。药理实验证明，丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、羟基红花黄色素A可使冠脉血流量明显增加，显著改善缺氧动物的氧分压和血氧饱和度，降低血粘度，抑制凝血和血栓形成，防止和减轻缺氧心肌超微结构的变化，对缺氧心肌有保护作用[3-5]。而在煎煮过程中这些成分很难保留，为保证药物疗效，本试验采用L9(34)正交试验法，以HPLC测定丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、羟基红花黄色素A含量为综合评价指标，优选出丹参、红花的最佳超声波提取工艺，为实际生产和临床应用提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器

LC-15C高效液相色谱仪、SIL-10AF自动进样系统、SPD-15C紫外检测器(日本岛津公司)；RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；Mill-Q超纯水处理系统(MilliporeBedford，MA，美国)；TG328B型分析天平(上海精科仪器厂)；KQ-100E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2药材与试剂

丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)、红花(CarthamustinctoriusL.)购于石家庄乐仁堂，经河北中医学院侯芳洁讲师鉴定，符合《中华人民共和国药典》2010版一部相关项下规定；丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110867-200406，110766-200518，110852-200806)；羟基红花黄色素A对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-13121913)；甲醇(色谱纯，批号：A2005-0001，美国 Grace公司)；乙腈(色谱纯，批号：TEN7949768，美国Grace公司)。

2 方法与结果

2.1丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(82∶18)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：270 nm；柱温：室温；进样量：10 μL。见图1～2[6-8]。

注：1.隐丹参酮；2.丹参酮I；3.丹参酮ⅡA。下同。图1 混合对照品高效液相色谱图

图2 样品高效液相色谱图

2.1.2 对照品溶液制备 取经五氧化二磷减压干燥的丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮适量，精密称定，置于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，于4 ℃冰箱中避光保存。丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮质量浓度分别为30.24、34.8、61.06 μg·mL-1。

2.1.3 供试品溶液制备 按处方比例称取1/2处方量的丹参、红花各7.5、6 g，加入15倍量50%甲醇，超声(电功率为100 W，频率为40 KHZ)提取2次，每次40 min，合并提取液。精密量取提取液适量，减压回收溶剂至近干，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得供试品溶液。

2.1.4 方法学考察 1)标准曲线：取对照品溶液，按2.1.1色谱条件分别进样5、8、10、15、18、20、25 μL，记录峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量(X，μg)为横坐标，进行线性回归，得线性回归方程，见表1。结果表明，在相应线性范围内，丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮进样量与峰面积呈良好线性关系；2)精密度试验：丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮峰面积的RSD分别为0.40%、0.37%、0.40%(n=6)，表明仪器精密度良好；3)稳定性试验：供试品中丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮峰面积的RSD分别为1.68%、1.67%、0.40%(n=6)，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性较好；4)重复性试验：丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮含量的RSD分别为1.53%、1.75%、1.04%(n=6)，表明方法重复性良好；5)加样回收率试验：精密吸取已知含量的供试品溶液9份于5 mL容量瓶中，3份为一组，加入混合对照品溶液1.06、1.33、1.60 mL，甲醇定容，测定，计算丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮平均加样回收率分别为97.17%、101.40%、99.22%，RSD分别为1.43%、1.54%、1.42%(n=9)。

2.2羟基红花黄色素A含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-0.1%磷酸(12∶88)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：403nm；柱温：室温；进样量：10μL。见图3～4。

2.2.2对照品溶液制备 取羟基红花黄色素A适量，精密称定，置于25mL棕色容量瓶中，加25%甲醇溶解并定容，于4℃冰箱中避光保存。羟基红花黄色素A质量浓度为111.20μg·mL-1。

2.2.3供试品溶液制备 按处方比例称取1/2处方量的丹参、红花各7.5、6g，加入10倍量50%甲醇，超声(电功率为100W，频率为40KHZ)提取3次，每次30min，合并提取液，精密量取提取液适量，减压回收溶剂至近干，用25%甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，即得供试品溶液。

表1 标准曲线的制备结果(n=7)

图3 羟基红花黄色素A高效液相色谱图

图4 样品高效液相色谱图

2.2.4 方法学考察 1)标准曲线：取2.2.2对照品溶液，按2.2.1色谱条件分别进样2、5、8、10、15、18、20 μL，记录峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量(X，μg)为横坐标，进行线性回归，得线性回归方程：Y=984 785.340 3X-34 569.875 4(r=0.999 7)。结果表明，在0.222 4～2.224 0 μg，羟基红花黄色素A进样量与峰面积呈良好线性关系；2)精密度试验：羟基红花黄色素A峰面积的RSD为1.45%(n=6)，表明仪器精密度良好；3)稳定性试验：供试品中羟基红花黄色素A峰面积的RSD为0.55%(n=6)，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性较好；4)重复性试验：羟基红花黄色素A含量的RSD为2.57%(n=6)，表明方法重复性良好；5)加样回收率试验：精密吸取已知含量的供试品溶液9份，3份为一组，于10 mL容量瓶中，加入对照品溶液1.20、1.50，1.80 mL，25%甲醇定容，测定，计算羟基红花黄色素A平均加样回收率为101.62%，RSD为1.50%(n=9)。

2.3正交试验优选丹参、红花提取工艺

2.3.1 正交试验设计与结果 在预试验基础上，选定乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取次数(C)、提取时间(D)为主要影响因素，以丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、羟基红花黄色素A为综合评价指标，综合评分[12]=(丹参酮I含量/最大丹参酮I含量+丹参酮ⅡA含量/最大丹参酮ⅡA含量+隐丹参酮含量/最大隐丹参酮含量)×25+羟基红花黄色素A含量/最大羟基红花黄色素A含量×75。采用L9(34)安排正交试验。提取工艺的因素与水平见表2，正交试验直观分析结果见表3，方差分析结果见表4[9-11]。

表2 提取工艺因素水平表

表3 提取工艺的正交试验结果

表3(续)

表4 提取工艺的方差分析结果

注：F0.05(2，2)=19。

由表4直观分析可知，各因素对提取效率影响大小为A>C>D>B。由方差分析结果可知，乙醇浓度和提取次数对提取效果的影响具有统计学意义。结合正交试验结果最佳提取工艺为A3B2C1D3，即加10倍量60%乙醇超声提取4次，每次50 min。考虑到试验效率并结合试验结果，确定每次提取时间为40 min。

2.3.2 最优提取工艺验证试验 按处方规定量称取丹参、红花药材，共3份，依据确定的最优工艺参数进行验证试验，结果丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、羟基红花黄色素A的平均质量分数分别为0.91、1.42、0.84、6.13 mg·g-1，RSD分别为1.65%、2.10%、2.31%、1.96%。结果表明优选的工艺稳定、可行。

3 讨论

为将葶苈生脉口服液开发为新药，“葶苈生脉口服液研究与开发”被列入2015年度河北省科技支撑计划项目。方中丹参、红花、川芎活血祛瘀，丹参中的丹参酮ⅡA等对光、热均较敏感，其溶液在光照、高温条件下易分解[13]；红花中的羟基红花黄色素A是红花活血化瘀有效成分，由于羟基红花黄色素A为热不稳定物质，在常压沸腾状况下随着时间的延长不断分解[14]。因此，本研究采用超声波提取，可以很好地控制提取过程中温度、光照对不稳定物质的影响。

丹参、红花中的药效成分性质相同，我们采用高效液相色谱法测定丹参中丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮与红花中羟基红花黄色素A含量，为平衡各指标对工艺优化的影响，使丹参与红花成分含量在综合评分中所占比例相同，最终确定综合评价指标为(丹参酮I含量/最大丹参酮I含量+丹参酮ⅡA含量/最大丹参酮ⅡA含量+隐丹参酮含量/最大隐丹参酮含量)×25+羟基红花黄色素A含量/最大羟基红花黄色素A含量×75[12]，旨在筛选更合理的提取工艺参数。

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Multi-indexEvaluationofIntegrationTechniqueforExtractingofSalviamiltiorrhizaandCarthamustinctoriusfromTingliShengmaidecoction

SHIHongxing1，ZHANGHuatan2，ZHANGJingyi2，LIChunhua3*

(1.HengshuiHospitalofTraditionalChineseMedicine，Hengshui053000，China；2.Past-graduateSchool，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China；3.Dept.ofTCM，HebeiUniversityofChineseMedicine，Shijiazhuang050091，China)

Objective：To optimize an integration technique for extracting ofSalviamiltiorrhizaandCarthamustinctoriusfrom Tingli Shengmai decoction.Methods：With composite score of contents of tanshinone I，tanshinone ⅡA，cryptotanshinone and hydroxyl safflower yellow A as index，orthogonal test was adopted to optimize extraction technology by taking the concentration of ethanol solid-liquid ratio extraction times and extraction time as factors.Contents of tanshinone I，tanshinone ⅡA，cryptotanshinone and hydroxyl safflower yellow A were determined by HPLC.Results：The optimal extraction process is thatSalviawas added with 10 times ethanol of 60% and extracted 50 minutes for 4 times.Conclusion：These optimized extraction processes are stable，feasible and suitable for industrial production of Tingli Shengmai decoction.

Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma；CarthamustinctoriusL.；extracting technology；orthogonal design；tanshinone I；tanshinone ⅡA；cryptotanshinone；hydroxyl safflower yellow A

河北省科技支撑计划项目(15272701D)

*

李春花，教授，研究方向：中药制剂新技术、新方法；E-mail：13803369966@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.022

2015-07-12)