曾燕，郭兰萍，王继永，崔秀明，杨光，王永炎，黄璐琦*

(1.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；2.中国中药公司，北京 102600；3.北京师范大学 资源学院，北京 100875；4.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650093)

·基础研究·

丛枝菌根侵染强度与二年生三七生物量和药效成分含量的相关性研究

曾燕1，2，3，郭兰萍1，王继永2，崔秀明4，杨光1，王永炎3，黄璐琦1*

(1.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；2.中国中药公司，北京 102600；3.北京师范大学 资源学院，北京 100875；4.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650093)

目的：研究丛枝菌根侵染强度对三七生长和药效成分皂苷的影响；方法：在大田条件下，对三七种子接种丛枝菌根真菌Glomusmosseae，生长二年后，随机采集100株三七，分株测定菌根侵染强度、地下部生物量和皂苷含量；结果：随着丛枝菌根侵染强度的增加，三七地下部生物量、人参皂苷Rd和四种皂苷总含量均出现明显地先增加而后出现下降趋势。同时，随着丛枝菌根侵染强度的增加，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd以及这四种皂苷的总产量均出现明显地先增加后下降的趋势。结论：丛枝菌根侵染强度与三七地下部生物量、皂苷含量及皂苷产量存在显著的相关性，具有低侵染增加，高侵染转而降低的现象。丛枝菌根适度侵染时三七有最大的生物量和最高的皂苷含量及皂甙产量。

丛枝菌根真菌(AMF)；菌根侵染；三七；皂苷；Hormesis

三七Panaxnotoginseng(Bruk) F.H.Chen是五加科人参属植物，是驰名中外的名贵中药材。现代药理学研究发现，三七在心脑血管系统疾病、免疫系统疾病、肿瘤等方面的治疗均具有很好的效果[1]。三七主要活性成分为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和三七素等。目前，三七均为人工栽培，病害严重，为控制三七病虫害的发生，药农加大了农药施用量，这不仅造成三七药材品质的下降，而且加重了产地环境的安全隐患。

作为自然界中广泛存在的生命共生体系，丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi，AMF)对于植物适应各种逆境胁迫具有重要意义。基于其对药用植物生长发育，抗逆性和药效成分都有积极的促进作用，近年来药用植物菌根研究逐渐成为热门的研究领域，中药材菌根栽培技术在优质绿色药材的生产方面具有潜在的优势[2-4]。

AMF对植物的侵染受诸多因素的影响，如土壤肥力、含水量、光照等[5-6]。对于菌根技术在药用植物中的应用，是否侵染强度越大越好？还是侵染强度在一定范围内时药用植物具有最大的产量或最高的药效成分含量？明确相关问题对于菌根技术应用于中药材栽培生产中具有重要的意义，将为中药材菌根技术的广泛应用和制定科学的栽培规程提供技术支撑。对此，本文以三七为例，对接种AMF的三七进行大样本取样，单株测定菌根侵染强度、药材生物量和皂苷含量，考察菌根侵染强度与药材生物量与药效成分含量的关系，以明确侵染强度与药材产量和品质的“量——效”关系。

1 材料和方法

1.1材料

试验所用丛枝菌根菌剂为GlomusmosseaeBGC XJ02(GM)。播种方法：在整理好的土壤上均匀地散上0.5cm厚的菌剂，覆盖土壤约2cm，播上三七种子，三七种子播种距离为2cm×2cm。而后在种子上覆盖土壤约2cm，盖上一层晒干的松针，第一次浇透水，以后保持土壤含水量30%左右。整个实验置于遮荫棚中，遮光率约为80%。土壤基本理化性质：有机质3.66%，全氮0.17%，全磷0.12%，全钾1.30%，碱解氮172.01mg·kg-1，速效磷14.21mg·kg-1，速效钾145.13mg·kg-1， pH5.7。

2009年12月进行播种栽培，于2011年10月采收三七，随机收集100株三七植株进行相关实验。三七地下部分用自来水冲洗干净后，用吸水纸吸干。同时单株收集少量三七须根段，用FAA固定液固定用于菌根侵染检查。三七药材置于鼓风干燥箱中50℃干燥。

1.2测定方法

菌根侵染情况观察：将采集的三七根透化染色：10%KOH，90℃，半小时透化；而后用1%H2O2清洗三次；加1%盐酸酸化；采用Phillips和Hayman[7]的染色方法进行根样染色观察。根据Trouvelot等[8]的方法，按照菌根侵染和丛枝丰度分级的标准，输入等级参数，用“mycocalc”软件，计算整个根系的菌根侵染强度(Intensityofthemycorrhizalcolonisationintherootsystem)：M%=(95n5+70n4+30n3+5n2+n1)/全部根段数。其中n5表示：5级侵染的根段数；n4表示：4级侵染的根段数，等等。

三七药材生物量测定：三七主要药用部位为地下部分。采收时将地上部分去除，地下部分用自来水快速刷洗干净，用吸水纸吸干，置于鼓风干燥箱中50℃烘干24h，称定干重即为三七药材干重。

三七药效成分含量测定：取三七药材粉末(过四号筛)0.5g，精密称定，精密加入甲醇50mL，称定重量，40℃超声40min，冷却后补足减失的甲醇，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液做为供试品。标准品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd购买于中国药品食品监督检验所。采用Waters2695高效液相色谱仪进行分析(HPLC)，色谱柱以18烷基硅烷键合为填充剂。分析时以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱；流速为1.5mL·min-1；检测波长为203nm，柱温为25℃。进样量为10μL。

1.3数据分析

每株三七的侵染强度对应该株三七的地下部生物量和皂苷含量，做散点图，二次函数拟合，SPSS17.0检验拟合的曲线的显著性。

2 结果与分析

2.1侵染强度与三七地下部生物量的相关性

随机取菌根化三七100株，单株测定侵染强度和地下部干重，分析其相关性。结果显示，随着菌根侵染强度的增加，三七生物量出现了明显的先增加，而后出现下降的趋势。即出现了双相剂量-反应曲线为特征的一种趋势。在侵染强度为20%～30%时，三七具有最大的生物量(图1)。

2.2侵染强度与三七皂苷含量的相关性

对菌根化三七随机取样100株，单株测定侵染强度和三七地下部三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的总含量，分析其相关性。结果显示，随着菌根侵染强度的增加，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的4种皂苷的总含量出现先增加，而后下降的趋势，即出现了双相剂量-反应曲线为特征的一种趋势。特别是人参皂苷Rd和四种皂苷的总含量出现这种效应的趋势很明显。菌根侵染强度在20%～30%时，三七具有最大的皂苷含量(图2)。

图1 AM真菌侵染强度与三七生物的相关性(n=100)

2.3侵染强度与三七皂苷产量的相关性

对菌根化三七随机取样100株，单株测定侵染强度、三七地下部的干重和三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的含量。根据相关数据计算出各皂苷成分单株的产量。以每株三七的侵染强度对应该株三七的皂苷产量，分析其相关性。结果发现，随着菌根真菌侵染强度的增加，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd及四种皂苷的总产量均出现先明显的先增加，而后下降的趋势，即出现了双相剂量-反应曲线为特征的一种趋势，菌根侵染强度为20～30%之间时，具有最大的皂苷产量(图3)。

图2 丛枝菌根真菌侵染强度与三七皂苷含量的相关性(n=100)

图3 AM真菌侵侵染强度对三七地下皂苷产量的影响(n=100)

3 结论与讨论

AMF作为植物共生的一种真菌，除了为寄主提供矿质营养，促进水分吸收之外，共生过程还能直接刺激植物防御物质(如次生代谢物)的形成[9-11]，相关研究在药用植物方面也多有报道。如接种AMF能促进白术、苍术、川黄柏、白芷、丹参、人参、半夏等药用植物的生长，提高特定药效成分含量[2-3]。是否随着AMF侵染强度的增加，药用植物生物量和特定药效成分含量也越高？有关AMF侵染强度与药用植物生物量和药效成分含量之间的“量——效”关系未见报道。研究人员考察过不同施肥量下AMF侵染对药用植物生长和药效成分的影响，认为在适当的施肥量下，AMF的侵染更有利于药用植物生物量和药效成分含量的积累[12-14]。虽然随着土壤施肥量的增加，AMF侵染强度会出现先增加后下降的趋势[6]，但不能简单地理解为AMF侵染强度与药用植物生物量或药效成分含量的“量——效”关系，毕竟土壤肥力的差异也是重要的影响因素。

在生物学研究领域中，有一种Hormesis现象，是指生物体在不同剂量(或程度)化学物质(或环境因子)刺激下产生的，以双相剂量——反应曲线为特征的一种适应性反应，即外来刺激物质对生物体产生的高剂量抑制，低剂量促进的现象，或称之为“毒物兴奋效应”、“化学兴奋效应”“低剂量促进效应”、或“低剂量有毒物质的刺激作用等[15-16]，这些刺激物可以是化学试剂、金属元素、也可以是病菌，产生的效应可以是植物生长发育指标，也可能是次生代谢物[17]。国内在药用植物研究中至今没有见到Hormesis的提法和具体的研究，但有少量类似的研究[17]。如低剂量镉和铅能使夏枯草果穗个数和果穗总量显著增加，而高剂量则出现抑制效应[18]；低剂量水杨酸增加了半夏株高、提高了叶绿素含量和SOD活性，同时还提高块茎产量[19]；随着NaCl浓度的增加，淫羊藿根、叶和箭叶淫羊藿根、茎、叶均呈现在低浓度范围内总黄酮含量增加，而在高浓度盐胁迫下总黄酮含量呈下降趋势[20]；低浓度Cd处理增加了青蒿中青蒿素含量，随着Cd浓度的增加，青蒿素含量又出现下降的趋势[21]。由于研究对象和观察指标的不同，目前尚无能够完全解释“hormesis”现象的发生机制[22]。

本研究发现：随着AMF侵染强度的增加，三七生物量、皂苷含量和皂苷产量均出现了明显的先增加后下降的趋势，侵染强度在一定范围时(20%～30%)，三七地下部生物量、皂苷含量和皂苷产量均可达到最大值。这是否可以称之为AMF侵染与三七生物量和药效成分的“hormesis”现象呢？这在菌根研究领域是一个比较有意思的现象，但就此提出菌根侵染的“hormesis”理论可能还欠妥，毕竟菌根侵染寄主是受多因素影响的，没有一个可简单控制的“剂量”，这还需要更为严谨的试验去验证。

AMF对三七生物量和药效成分含量之间的低侵染促进，而高侵染转而抑制的现象，对于指导中药材的生产具有重要意义：可以通过调节栽培过程中的水分、肥力和光照等因子来调节AMF对药用植物的侵染强度，从而获得较高的药材产量和较好的药材品质。

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RelationshipbetweenIntensityoftheMycorrhizalColonisationinRootSystemandBiomassorSaponinsContentofPanaxnotoginseng

ZENGYan1，2，3，GUOLanping1，WANGJiyong2，CUIXiuming4，YANGGuang1，WANGYongyan3，HUANGLuqi1*

(1.NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；2.NationalTraditionalChineseMedicineCorporation，Beijing100195，China；3.CollegeofResourcesScience&Technology，BeijingNormalUniversity，Beijing100875，China；4.FacultyofLifeScienceandTechnology，KunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650093，China)

Objective：To research the effect of mycorrhizal colonisation on the growth and saponins content ofPanaxnotoginseng.Methods：The effects of AMF on the growth and the saponins content in the root ofP.notoginsengwere examined by introducing exogenousGlomusmosseaeinto two years plants under field condition.Results：With the increasing of intensity of the mycorrhizal colonization，it showed a trends of increase first and then decrease for the biomass，ginsenoside Rd and total contents of notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1and ginsenoside Rd in the inoculated plants.Conclusion：There was a strong correlation between the intensity of the mycorrhizal colonization and the plant biomass or contents and total yield of saponins.When the intensity of the mycorrhizal colonization was intermediate range，the biomass，saponins contents and saponins amount reached maximum.

Arbuscularmycorrhiza fungi (AMF)；mycorrhizal colonization；Panaxnotoginseng；saponins；hormesis

*

黄璐琦，研究员，研究方向：分子生药、中药资源；Tel：(010)64011944，E-mail：huangluqi01@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.006

2014-12-02)