贾蔓箐，唐辉，*，李翠华，王国军，赵红涛

（1.新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子大学药学院，新疆石河子 832000；2.石河子大学化工学院，新疆石河子 832000）

棉油皂脚中植物甾醇的提取工艺研究

贾蔓箐1，唐辉1，*，李翠华2，王国军1，赵红涛1

（1.新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子大学药学院，新疆石河子 832000；2.石河子大学化工学院，新疆石河子 832000）

摘 要：为了探索从棉油皂脚中提取植物甾醇的工艺条件。以皂脚为原料，通过单因素和正交实验优化最佳工艺条件，并对粗品进行纯化，以高效液相色谱法测定的甾醇含量为考察指标。植物甾醇提取的最佳工艺为：皂化料液比1∶3，90℃下皂化3 h，用乙酸乙酯进行萃取，料液比为1∶20，粗甾醇的提取率为75.6%，其中提取得到的β-谷甾醇和菜油甾醇的纯度分别为（66.5±0.47）%、（5.67±0.08）%，其经无水乙醇重结晶两次后，纯度可达91.8%。结果表明最佳提取工艺重现性较好；HPLC法测定甾醇含量结果准确可靠。

关键词：棉油皂脚；植物甾醇；HPLC；提取

棉油皂脚是棉籽油生产过程中产生的下脚料，在碱炼脱酸过程中采用氢氧化钠溶液将毛油中的游离脂肪酸中和为钠盐，主要成分为高级脂肪酸（脂肪酸钠盐）[1]，并且同时含有棉酚[2]、甾醇、磷脂等高附加成分。我国每年可排放植物油皂脚数百万吨，寻找新的处理方法并提取出有效成分，不仅保护环境，还具有很高的经济价值。

植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲（即甾核）为骨架的类似环状醇结构的化合物，具有显著的降胆固醇功效，还具有免疫调节，消炎退热，防治心脏病等许多重要的生理功能[3-4]，近年来，甾醇在医药、食品、化工等领域被高度重视与关注[5]。在大多数已报道的研究中，一般都以脱臭馏出物作为提取原料，用不同的方法加以提取[6-10]。本实验以棉籽油皂脚为原料提取植物甾醇，建立HPLC法准确定量，探索了一条合理工艺提取皂脚中的植物甾醇，以促进资源的合理利用。

1 材料与方法

1.1 材料

棉油皂脚（新疆康隆油脂公司，批号1：111203，批号2：120221）；β-谷甾醇对照品（上海源叶生物制品有限公司，批号：20120214）菜油甾醇对照品（日本和光Wako，批号：2301）

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

日本岛津LC-15C高效液相色谱仪（包括在线脱气机、紫外检测器、LC solution工作站等）；德国Staotious BP211D电子分析天平；AR1140万分之一电子分析天平：奥豪斯国际贸易有限公司；DKZW—C型电子恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；TP 300超声波清洗器：天鹏电子新技术有限公司；德国EYELA旋转蒸发仪；A-1000S水流抽气机：made by EYELA；CCA-20低温冷却水循环泵；

1.2.2 试剂

甲醇色谱纯（Fisher Science），重蒸水；所用其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 甾醇的提取工艺

取棉油皂脚100 g于圆底烧瓶内，加入适量1 mol/L的氢氧化钾-乙醇溶液，高温回流，减压蒸馏回收乙醇。加入蒸馏水稀释，将得到的皂化液冷却，有机溶剂萃取2次，水洗至中性，在常温下减压蒸馏回收有机溶剂，得到粗甾醇制品。

2.2 单因素实验

选择影响甾醇提取率的几个因素：即皂化料液比（皂脚质量与1 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液的体积比）、皂化时间、萃取剂的选择、萃取料液比（皂脚质量与有机溶剂的体积比）分别进行单因素实验，采用HPLC法在210 nm处进行植物甾醇的含量考察各因素对甾醇提取率的影响。

2.3 正交试验

为了全面考察影响因素，设计并进行L9（34）正交试验，确定提取棉油皂脚中植物甾醇的最佳提取参数。设定因素水平表如表1。

表1 正交设计因素水平表Table 1 Table of factors and levels of orthogonal design

2.4 粗甾醇的精制

称取一定量的粗植物甾醇，加入60℃无水乙醇充分溶解，降温至-5℃结晶18 h～24 h。在低温条件下迅速抽滤，并用无水乙醇冲洗滤渣表面，滤渣在真空烘箱中50℃下干燥。干燥后的滤渣重复上述重结晶步骤，即可得到精制甾醇。

2.5 植物甾醇的测定

2.5.1 色谱条件

色谱柱：WondaSil Analysis C18 Column（4.6 mm×150mm，5μm）；流动相：甲醇∶水=95∶ 5；流速 0.8mL/min；检测波210 nm；进样量20 μL；柱温25℃。植物甾醇在此条件下有较好的分离，色谱图如图1所示。

图1 甾醇对照品及粗品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of reference and sample

2.5.2 标准曲线的绘制

采用高效液相色谱法测定。β-谷甾醇：Y=3 543.3X+25 769（R=0.999 9）；菜油甾醇：Y=3 573.6X+29 579（R=0.999 8）。在 40.16 μg/mL～240.96 μg/mL 和30.02 μg/mL～181.2 μg/mL 范围内线性关系良好，精密度分别为0.70%、0.49%。

2.5.3 供试品测定

分别取 3批原料（批号：111203），按“2.1”项下方法制备粗品甾醇，无水乙醇溶解，用微孔（0.45 μm）滤过按上述色谱条件进行测定。重复进样3次，取平均值，根据回归方程计算粗品中甾醇的纯度及提取率。

3 结果与分析

3.1 提取条件单因素的考察

3.1.1 皂化料液比对甾醇提取率的影响

按2.1工艺提取植物甾醇，在反应温度90℃，反应时间3 h的条件下对皂脚进行再次皂化，考察料液比（皂脚质量与1 mol/L氢氧化钾－乙醇溶液的体积比）对皂化反应的影响，结果如图2所示。

图2 皂化料液比对提取率的影响Fig.2 The effect of solid-liquid on extraction

由图2可知，当料液比小于1∶3时，随着碱液量的增加，甾醇提取率也随之增加，这是因为皂化的目的是除去脂肪酸和分解甾醇酯，皂化越趋完全，甾醇越易被提取，碱液量过少，皂化不完全，甾醇纯度低且提取率低；当料液比大于1∶3时，随着碱液量过多，会造成试剂浪费并且引入杂质，甾醇提取率反而略下降。所以选取料液比为1∶3。

3.1.2 皂化时间对甾醇提取率的影响

按2.1工艺提取植物甾醇，在皂化料液比1∶3，反应温度90℃的条件下对皂脚进行皂化，考察皂化时间对皂化反应的影响，见图3。

图3 皂化时间对提取率的影响Fig.3 The effect of different time on extraction

由图3可知，当反应时间小于3 h时，随着反应时间的延长，甾醇提取率随之增加，因为在皂化反应中物质的传递和反应需要一定时间，但是时间过长可能由于甾醇氧化或引入杂质导致结果有所降低，从生产考虑，皂化反应达到3 h时即可。

3.1.3 最优萃取溶剂的选择

按2.1工艺提取植物甾醇，在皂化料液比1∶3，反应温度90℃回流3 h的条件下对皂脚进行皂化，分别选用乙酸乙酯、丙酮、氯仿、异丙醇、石油醚、乙醚进行萃取，考察最优萃取溶剂见图4。

图4 不同有机试剂对提取率的影响Fig.4 The effect of different solvent on extraction

从图4看出不皂化物中萃取植物甾醇效果：乙酸乙酯＞石油醚＞乙醚，并且乙酸乙酯毒性低，不溶于水，更加利于实际操作，故萃取溶剂选乙酸乙酯。

3.1.4 萃取料液比对甾醇提取率的影响

按2.1工艺提取植物甾醇，在皂化料液比1∶3，反应温度90℃回流3 h的条件下对皂脚进行皂化，选用不同体积的乙酸乙酯进行萃取，考察萃取料液比对甾醇提取率的影响见图5。

图5 萃取料液比对提取率的影响Fig.5 The effect of solid-liquid on extraction

随着萃取剂用量增加，甾醇提取率也增大。这是因为萃取剂用量越多，溶解在萃取剂中的甾醇越多，但在萃取料液比1∶20以后，甾醇提取率提升并不显著，这是由于甾醇已基本溶于萃取剂中了，再增加萃取剂用量对甾醇的结果影响不大。由图可知，萃取料液比为1∶20即可。

3.2 正交试验

以料液比、反应时间和萃取剂用量设定的L9（34）正交试验结果如表2。

由直观分析和方差分析表可知，影响棉油皂脚中甾醇提取的主次因素依次为A（皂化料液比）＞B（皂化时间）＞C（萃取料液比），由表中可知，最优工艺为A2B2C3，综合考虑辅料成本与效益，后续操作等因素，得出最佳工艺条件为A2B2C2，即100 g原料，采用皂化料液比1∶3高温回流3 h，乙酸乙酯进行萃取，萃取料液比为 1∶20 g/mL。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experimental results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

3.3 工艺验证性实验结果

按照上述确定的最佳条件，进行3次平行试验，棉油皂脚中植物甾醇提取率为75.6%，说明正交试验筛选所得的工艺稳定可行。

3.4 粗品甾醇的精制结果

对粗品甾醇进行重结晶精制，二次精制后纯度可达91.8%，其中含有β-谷甾醇85.4%，菜油甾醇6.4%。

4 结论

1）选用HPLC法测定甾醇含量，此法快速、准确、重复性高，可用于测定棉油皂脚中甾醇含量及提取物纯度的测定。

2）通过单因素和正交试验，得到自棉油皂脚中提取甾醇的最优条件：皂化料液比1∶3，高温下回流皂化3 h，萃取料液比1∶20进行萃取，在此条件下，粗品植物甾醇的平均提取率为75.6%，β-谷甾醇和菜油甾醇的纯度分别为（66.5±0.47）%、（5.67±0.08）%，对粗品甾醇进行重结晶，二次精制后纯度达91.8%。

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Study on Extraction Process of Phytosterols in Cottonseed Soapstock

JIA Man-qing1，TANG Hui1，*，LI Cui-hua2，WANG Guo-jun1，ZHAO Hong-tao1
（1.Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resources，College of Pharmacy of Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China；2.College of Chemistry of Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

Abstract：The process of extracting phytosterols from Cottonseed Soapstock has been established.Methods：The conditions have been optimized through single factor and orthogonal experiments.The crude extract was purified and the content of phytosterols was determined by HPLC.Results：Optimum extraction conditions were as follows：the Liquid-material ratio is 1∶ 3；saponification time is 3 h at 90℃；the extraction was carried out with ethyl acetate and the liquid-material ratio is 1∶ 20；the yield of the crude phytosterols is 75.6%and the purity of β-sitosterol and campesterol is （66.5±0.47） %and （5.67±0.08） %， respectively.The purity of total phytosterols has been enhanced from 70%to 91.8%after recrystallization with anhydrous ethanol twice.Conclusion：The optimized extraction process indicates satisfied repeatability and the method for determining phytosterols by HPLC is accurate and reliable.

Key words：cottonseed soapstock；phytosterols；HPLC；extraction

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.012

新疆建设兵团博士基金项目（2009JC14）；石河子大学重大科技攻关计划项目（gxjs2010-zdgg04）

贾蔓箐（1988—），女（汉），硕士，研究方向：天然药物分析。

2013-01-29