陈 默,范湛蓝,高 群,高福梅,牟 迪,胡建英（北京大学城市与环境学院,地表过程分析与模拟教育部重点实验室,北京 100871）

北京女性尿液中双酚A及氯代双酚A的浓度和风险评价

陈 默,范湛蓝,高 群,高福梅,牟 迪,胡建英*（北京大学城市与环境学院,地表过程分析与模拟教育部重点实验室,北京 100871）

建立了有机相丹酰化衍生-UPLC-MS-MS人体尿液样品中双酚A（BPA）及4种氯代双酚A（氯代BPA）的检测方法,对北京地区40个女性尿液样品进行了检测.结果表明：BPA和一氯、二氯、三氯、四氯 BPA的检出率分别为90%、96%、90%、52%和 45%；浓度分别为（1.30±1.24）,（0.40±0.37）,（0.41±0.51）,（0.18±1.49）,（0.46±0.35） ng/mL,4种氯代BPA的总浓度为1.45ng/mL,和BPA浓度相仿.4种氯代BPA的BPA等当量浓度为4.84ng/mL,是BPA浓度的2.2倍. 40个尿液样本BPA等当量浓度符合对数正态分布,超过BPA的糖尿病发生阈值（0.05%发病风险）5.7ng/mL的概率为19.2%.人体暴露氯代BPA的健康风险应该引起重视.

氯代双酚A；丹酰化衍生；摄入量；等当量；LC-MS-MS

双酚A是一种典型内分泌干扰物,广泛存在于各种环境介质中,在饮用水和人体中也都有检出［1］.已有文献证明,饮用水主要单元的氯消毒过程中BPA会转化成各种氯代消毒副产物,并且一氯和二氯BPA的雌激素结合活性远高于BPA［2］,最近在全国33个省会城市饮用水中检出了这些氯代消毒副产物［3］,因此为了综合评价BPA的健康风险,有必要展开该类物质的人群暴露评价.

最近有多篇论文报道了人群中氯代BPA的暴露水平.在法国21个母乳样品中发现二氯双酚A的检出率高达 100%,其浓度水平（3.43ng/mL）甚至高于 BPA（1.87ng/mL）［4］.在妇女胎盘中一氯、二氯和三氯BPA的检出率分别为51%、51%和49%,浓度范围分别为5.1～21.4,12.7～58.8,4.0～31.2ng/g,高于 BPA浓度水平（5.7～22.2ng/g）［5］.妇女脂肪组织样品中主要检出了二氯 BPA （9.21ng/g）,平均浓度也高于 BPA（5.83ng/g）［6］.尿液样品具有便于获得、容易收集、适于大规模人群暴露调查的特点. BPA和氯代BPA都是亲水性含有酚羟基物质,容易被二相酶代谢排泄,在尿液中具有较高浓度,对于这类物质,尿液是研究人群暴露量的理想生物样品.已有多篇论文尝试检测人体尿液中氯代 BPA,其检出率普遍较低（小于 20%）［7-9］,其主要原因之一可能是缺乏高灵敏度的检测方法.

本研究以 BPA、Cl-BPA、Cl2-BPA、Cl3-BPA、Cl4-BPA为对象物质,建立了尿液中对象物质的有机相丹酰化衍生的高灵敏度检测方法,并将其用于 40个北京妇女尿液中上述对象物质的检测.计算了尿液样品中 BPA的等当量浓度,并通过一个单室模型反演了总摄入量,评价了其健康风险.

1　材料与方法

1.1样品的采集

本研究中的40个尿液样品于2014年1月～2015年 2月采集于北京大学人民医院门诊部,前来体检的志愿者尿液样品（已征得知情同意）.研究表明,双酚A与糖尿病、甲状腺疾病、复发性流产等疾病存在相关性［10-12］.本研究的所有志愿者都没有与BPA有关的职业暴露、无吸烟史、无糖尿病、甲状腺疾病等代谢相关疾病、无高血压、心脏病等心血管相关疾病.

用50mL玻璃小烧杯收集,后转移入8mL棕色玻璃样品瓶,由干冰保存运输至实验室,放入-20℃保存直至检测.

1.2标准品

4种氯代 BPA的标准品由本实验室合成［3］,所有标样的纯度都大于95%.物质结构式见图1.

图1　BPA及氯代BPA的结构Fig.4　Structures of BPA and chlorinated BPAs

1.3样品前处理

尿液样品解冻后立即取0.5mL混合均匀后的全尿,置于 8mL玻璃培养管中,加入 0.5ng BPA-d14内标,0.1mL 0.14mol/L的磷酸盐缓冲液和 0.1mL的葡萄糖醛酸（β-glucuronidase）-硫酸（β-arylsuflatase）混合水解酶（Roche Diagnostics GmbH, Mannhein, Germany）后,置于37℃培养箱中水解反应3h.水解后取出玻璃管,加入0.5mL超纯水和3mL叔丁基甲醚（MTBE）,振荡10min后在3000r/min下离心5min,取上层有机溶液；重复萃取一次,两次液液萃取的提取液混合后在微弱氮气下吹干,用 1mL乙腈定容.添加 0.2mL的30mg/mL的丹磺酰氯（DNS）和4-（二甲氨基）吡啶（DMAP）混合溶液,充分振荡混合后放入 65℃烘箱放置1h.反应结束后,加1mL超纯水、3mL正己烷溶液,重复提取两次.得到的有机层溶液通过6cm3,1g规格的Silica SPE小柱（Waters, USA）净化,经5mL正己烷：二氯甲烷1：1（体积比）溶液淋洗,用5mL二氯甲烷：丙酮9：1（体积比）溶液洗脱,在微弱氮气下吹干,最后加入0.5mL乙腈定容用于UPLC-MS-MS分析.

1.4仪器分析

表1　双酚A及氯代双酚A的选择离子和质谱检测参数Table 1　Multi-selected reaction monitoring （MRM）conditions for bisphenol A （BPA） and chlorinated BPA

用 ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（Waters, USA）对各目标物进行分离.液相色谱柱采用 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1mm×50mm×粒径 1.7 μm）（Waters, USA）,流动相为乙腈和含 0.1%甲酸的纯水,色谱柱温度为 40℃,流速 0.3mL/min,进样体积5μL.液相梯度洗脱条件：乙腈初始比例为 60%,在 0～0.5min内线性增加为 75%,从 0.5～6.5min线性增加为80%, 6.5～7min线性增加至95%,保持2min后, 在0.5min内线性增加到100%,保持2min后,立即回到初始流动相条件平衡 1.0min.所用质谱为 Quattro Premier XE 串联四级杆质谱仪（Waters, USA）,采用正离子模式的 ESI离子源, 在MRM模式下对目标物进行检测.质谱参数为：毛细管电压3.5kV；源温度120℃；脱溶剂气温度450℃；锥孔气流量50L/h；脱溶剂气流量800L/h. BPA及氯代 BPA的选择离子和质谱检测参数见表1.

1.5质量保证与质量控制（QA/QC）

本研究中对于样品中目标物质的定性主要依据：（1）与标样相比保留时间相差在2%以内；（2）与标样相比,2个选择离子峰面积之比相差在20%以内.目标物质的定量选用丰度最高及背景干扰最小的MRM选择离子,同时用内标校正前处理和基质干扰引起的损失,并用以消除仪器波动的影响.由于双酚A无处不在,为了消除过程空白,前处理过程中仅使用色谱纯、农残级的有机溶剂和在马弗炉中450℃烘烤4h以上的玻璃器皿.为了评估空白和基质效应,每一组（10个）样品跟随1个过程空白、1个基质加标样品作为质量控制.本研究通过向尿液样品中加入 0.05,0.5, 2ng/mL 3个不同浓度水平的标样,用以评估本实验的回收率以及标准曲线的线性范围.

2　结果与讨论

2.1分析方法的优化

水相DNS衍生LC-MS-MS方法不仅仅具有高灵敏度,而且能克服 LC-MS-MS分析中常见的基质效应高的问题,该方法已经应用于环境水样中雌激素类物质和饮用水中双酚A及其氯代 BPA的方法的检测［3,13］.本研究也尝试该方法用于人体尿液样品中BPA及氯代BPA的检测,但是该方法分析人体尿液样品时对于三氯、四氯双酚A衍生效率较低,基质效应依然严重.因此本研究参考文献［14］,采用有机相DNS+DMAP衍生LC-MS-MS检测方法分析尿液中 BPA及氯代BPA.

尿液通过MTBE液液萃取,衍生后,Silica纯化,用UPLC-MS-MS进行定量,对不同添加浓度下的回收率进行了评估（表3）.在低（0.05ng/mL）、中（0.5ng/mL）、高（2ng/mL）3种添加浓度下,BPA及其氯代BPA的回收率在62%～108%之间（n=3）,内标BPA-d14回收率分别为76%、80%和96%（表2）.表3同时比较了不衍生、水相DNS衍生、有机相DNS+DMAP衍生LC-MS-MS方法的检出限（LOD）,发现BPA、一氯BPA和二氯BPA的有机相DNS+DMAP衍生灵敏度和水相DNS衍生相似；但是三氯、四氯 BPA的灵敏度相比水相DNA衍生提高了5倍.本研究的灵敏度高于文献报道方法［8-9］,特别是一氯BPA和二氯BPA的检测下线是文献的1/100～1/9.5种目标物质的基质抑制率在1%～6%之间.

表2　双酚A及其氯代衍生物的回收率及标准曲线参数Table 1　Recovery and standard curve parameters of bisphenol A and chlorinated BPAs

表3　目标物质未衍生和两种衍生方法的检出限和选择离子比较Table 1　LOD and transition monitored m/z of nonderivatization and two different derivatization methods

2.2人体尿液样品中BPA及其氯代物质浓度水平

本研究人体尿液中 BPA的检出率为 90%,低于比利时（96.9%,n=66）、美国（94%,n=210）、日本（100%,n=48）和瑞典（100%,n=95）女性尿样中BPA的检出率［15-18］,但高于我国华东和华中地区女性（44%,n=503）［19］、和广州、上海、哈尔滨的女性人群相同（90%,n=55）［20］.这可能与我国不同地区、同一地区不同人群的饮食习惯差异与饮水来源差异有关.

本研究人体尿液中 BPA的平均浓度为（1.30±1.24） ng/mL（几何均值：0.84ng/mL, ＜MDL～5.32ng/mL）,和美国（几何均值：1.12ng/mL, ＜MDL～5.18ng/mL）相近,比日本（1.2ng/mL, 0.2～19.1ng/mL）、比利时（几何均值：2.40ng/mL, ＜MDL～23.40ng/mL）,瑞典（几何均值：1.31ng/ mL）［15-18］和广州、上海、哈尔滨（几何均值：1.00ng/mL,0.57～1.36ng/mL）［20］女性尿液中 BPA的水平低,但是高于我国华东和华中地区的女性（几何均值：0.58ng/mL）［19］.

北京人体尿液中都检出了 4种氯代 BPA,其典型的色谱图如图2.二氯BPA的检出率最高, 为 96%,其次是一氯 BPA（90%）、四氯BPA（52%）、三氯BPA（45%）.目前仅有4篇文献报道了尿液中氯代BPA的浓度水平.法国10个尿液样品中一氯BPA、二氯BPA、三氯BPA和四氯BPA的检出率分别为30%、20%、30%、30%［8］.美国人体尿液（n=31）中一氯 BPA、二氯BPA和三氯 BPA的检出率分别为 16.1%、19.4%、19.4%（四氯BPA未研究）［7］.另一美国人群（n=224）尿液中一氯BPA的检出率为90%（二氯BPA、三氯BPA、四氯BPA未研究）［21］.西班牙的20个成人尿液中没有检出氯代BPA［9］.本研究的一氯、二氯、三氯、四氯BPA的检出率均高于上述文献报道,这个可能和本研究开发方法的检出限有关.

图2　尿液样品中目标物质的典型色谱图Fig.4　Chromatograms of target substances in urine samples

本研究尿液样品中一氯BPA、二氯BPA、三氯 BPA和四氯 BPA的浓度水平分别为（0.40±0.37） ng/mL（＜MDL～1.70ng/mL,几何均值0.01ng/mL）、（0.41±0.51） ng/mL（＜MDL～2.60ng/ mL,几何均值=0.01ng/mL）、（0.18±1.49） ng/mL（＜MDL～1.95ng/mL,几何均值 0.01ng/mL）、（0.46±0.35）ng/mL（＜MDL～1.72ng/mL,几何均值0.04ng/mL）,4种氯代物质的总浓度为1.45ng/mL,略高于BPA的浓度水平,低于美国人群（n=31）尿液中一氯BPA、二氯BPA、三氯BPA的浓度水平（几何均值分别为 0.049,0.055, 0.047ng/mL,未研究四氯 BPA）［7］,但是略高于美国的另一个研究中报道的人群（n=224）尿液中一氯BPA的平均浓度（0.083ng/mL,未研究其他氯代 BPA）［21］和法国人群（n=10）尿液中四种氯代BPA的浓度水平（一氯BPA、二氯BPA、三氯BPA、四氯BPA的平均浓度分别为0.06,0.02, 0.21,0.09ng/mL）［8］.

研究发现,氯代 BPA广泛存在于我国主要省会城市的饮用水中［3］,一氯 BPA和二氯 BPA的检出率接近100%,三氯、四氯BPA检出率分别为60%和50%,这与尿液中三氯、四氯BPA检出率低于一氯、二氯 BPA的趋势相似.一氯和二氯 BPA在尿液和饮用水中均为氯代BPA最主要的组成形式（图 3）,说明饮用水可能是氯代BPA的来源之一.但是尿液中氯代BPA的组成比例显著大于饮用水,氯代 BPA可能有其他暴露途径.四氯 BPA的检出率和浓度水平高于三氯BPA.四种氯代BPA中,只有四氯BPA是工业产品,主要作为阻燃剂添加于环氧树脂、酚醛树脂中,有可能通过各种途径进入环境,从而可能导致了人体尿液中四氯 BPA的暴露量高于饮用水中的贡献.

研究发现,一氯、二氯BPA的雌激素活性要高于BPA本身,4种氯代BPA的雌激素活性分别为BPA的7.40、4.19、0.58、0.11倍［3］由此计算出尿液样品的BPA等当量浓度为6.14ng/mL,约为尿液中 BPA和 4种氯代 BPA的浓度总和（2.75ng/mL）的2.2倍（图4）.经SPSS（v18.0）软件中的 Shapiro-Wilk检验,得到本研究的40个尿液BPA等当量浓度服从对数正态分布,几何均值2.67ng/mL,几何标准差为2.38ng/mL,分布函数如式（1）所示：

式中： x表示尿液BPA等当量浓度.

图3　40个人体尿液样品中BPA及氯代BPA的浓度水平及比例Fig.4　Concentrations and proportion of Bisphenol A and chlorinated analogues in 40 human urine samples

氯代BPA在尿液中的高检出率、高总浓度和高等当量浓度表明氯代BPA比BPA可能具有更大的健康风险,应引起重视.

图4　尿液浓度（A）和BPA等当量浓度（B）比较Fig.4　Comparison of urine concentration （A） with toxic equivalent quantity （TEQBPA） in urine （B）

2.3BPA及氯代BPA的健康风险评价

在人体中,经口摄入的 BPA绝大部分会在24h内由肝脏代谢成葡萄糖醛酸结合态和硫酸结合态,并经过尿液排出体外.经口摄入是人体暴露BPA的最主要暴露途径,占总暴露量的90%以上［22］.因此可以建立一个简化的单室模型（式 1）,用式（2）从尿液BPA含量反演计算人体BPA日摄入剂量（EDI,μg/（kg∙d））：

式中：Cu为尿液中 BPA类物质的浓度（μg/L）,Vu为每日排尿量（L/d）,W为体重（kg）.参考国际放射性保护委员会（ICRP）的数据,女性平均每天的排尿量为1.2L/d［23］.参考《中国人群暴露参数手册》的数据,中国成年女性平均体重为56.8kg［24］.假定氯代BPA在人体内的代谢行为和BPA相同,根据尿液中氯代BPA总浓度和等当量浓度的比例关系,计算出 BPA等当量的 EDI为 0.125μg/ （kg∙d）.

已有报道的BPA毒性终点包括体重减少、子宫和子代重量减少、影响子代神经系统发育等［25-27］.其中,美国EPA、FDA等多家机构将体重减少作为毒性终点,其NOEAL值为5mg/（kg∙d）,并根据公式（3）计算得到日允许摄入量（TDI, mg/（kg∙d））为50μg/（kg∙d）［28-29］：

式中：UF为不确定系数,包含 10倍种间差和10倍的个体差异.北京妇女中的BPA等当量摄入量远低于TDI值,超过TDI值的概率＜0.01%,处于较低的风险水平.

除了体重减少之外,美国国家毒理学项目组（NTP）专家组2012年提出了人体BPA暴露可能引起糖尿病发生［30］.许多动物实验研究也表明,BPA通过干扰胰岛素耐受性、损坏血糖稳态和胰岛细胞功能等而诱发糖尿病的发生［31-33］.另有研究发现BPA暴露能够造成小鼠脂肪细胞糖转运功能异常,从而间接增加患糖尿病风险［34］.2008年Lang等［35］基于包括1455个样本的横断面研究,发现了尿液BPA浓度与糖尿病的发生具有显著相关关系.Silver等［36］利用同样的样本库,将样本量增加到4389例,建立了尿液中BPA浓度与糖尿病发生率之间的剂量效应关系（表4）.

表4　文献中BPA尿液浓度与糖尿病的关系［36］Table 1　Relationship between urine BPA level and diabetes

本研究采用了该文献［36］中所建立的剂量效应关系（表4）.借鉴二噁英等物质对剂量区间的处理方法［37］,本研究取表4中尿液BPA区间浓度的平均值,和最高浓度的2倍,作为剂量（表4）.在此基础上,利用 USEPA的 Benchmark软件（BMDS V2.4）对糖尿病发生为终点的尿液 BPA BMDL5（发病风险增加 0.05%对应的浓度）进行了计算.并在计算过程中尝试采用了 Logistic、Probit和Quantal-Linear 3种模型进行拟合,结果表明Quantal-linear模型拟合效果最好, BMDL5为5.7ng/mL.本研究40个尿液样本BPA等当量浓度符合对数正态分布,频率分布如图5所示：

图5　北京40个女性尿液BPA等当量浓度的频率分布Fig.4　Distribution of toxic equivalent quantity （TEQBPA）in 40 urine samples

利用尿液BPA等当量浓度的频率分布,可得到本研究中北京人体样品尿液BPA等当量浓度超过5.7ng/mL的概率为19.2%,说明目前的暴露BPA存在一定的糖尿病风险.

3　结论

3.1建立了人体尿液样品中 BPA及四种氯代BPA的有机相丹酰化衍生-UPLC-MS-MS检测方法,其方法回收率为 62%～108%,检出限为0.001～0.03ng/mL.

3.240个北京地区女性尿液样品中的一氯BPA、二氯BPA、三氯BPA和四氯BPA的总浓度水平和BPA的浓度水平相仿.4种氯代BPA的BPA等当量浓度是BPA浓度的2.2倍.

3.3尿液样品的BPA等当量浓度为6.14ng/mL,本研究人体样品中有超过了BPA的糖尿病发生的阈值（0.05%发病风险）的概率为19.2%.

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Levels and risk assessment of bisphenol A and chlorinated BPAs in urine samples of Beijing women.

CHEN Mo, FAN Zhan-lan, GAO Qun, GAO Fu-mei, MU Di, HU Jian-ying*（College of Urban and Environmental Sciences, Peking University, Beijing 100871, China）.

China Environmental Science, 2015,35（9）：2853～2860

A derivatization UPLC-MS-MS method was used to analyze bisphenol A （BPA） and its chlorinated derivatives, including monochloro-BPA, dichloro-BPA, tricholro-BPA, and tetrachloro-BPA, in 40urine samples of Beijing women. The detection frequencies of BPA, monochloro-BPA, dichloro-BPA, tricholro-BPA, and tetrachloro-BPA were 90%, 96%, 90%, 52%, and 45% with average concentrations of （1.30±1.24）, （0.40±0.37）, （0.41±0.51）, （0.18±1.49）, （0.46±0.35）ng/mL, respectively. While the total concentration of four chlorinated BPA was 1.45ng/mL, which was similar with that of BPA in urine, their BPA toxic equivalent quantity （TEQBaP） in urine was calculated to be 4.84ng/mL, which was 2.2 fold higher than that of BPA. The TEQBPAconcentration was log-normally distributed, and the probability higher than Benchmark Dose （BMDL0.05）, corresponding to the increasing risk of diabetes by 0.05% due to exposure to BPA, was 19.2%. Our results indicated that chlorinated BPA might pose a relatively high risk.

chlorinated BPA；DNS derivatization；daily intake estimates （EDI）；toxic equivalent quantity （TEQ）；LC-MS-MS

X503.1

A

1000-6923（2015）09-2853-08

2015-02-08

水体污染控制与治理科技重大专项（2014ZX07405001）

*责任作者, 教授, hujy@urban.pku.edu.cn

陈 默（1990-）,男,安徽怀远人,北京大学城市与环境学院硕士研究生,主要从事环境和人体中双酚A类物质的行为研究.