刘 洋， 尚 勇， 李 卓， 肖天舒， 郝立君

实验研究

不同年龄女性脂肪干细胞生物学特性的比较

刘 洋， 尚 勇， 李 卓， 肖天舒， 郝立君

目的 探索不同年龄女性脂肪干细胞在细胞形态、表面标志物表达、生长特性及分化潜能方面的差异。方法 获取不同年龄女性脂肪组织，分离出脂肪干细胞，观察细胞形态，比较细胞增殖能力；采用流式细胞术检测细胞的免疫表型，诱导分化检测成脂、成骨分化潜能。结果 ⑴所有脂肪干细胞均呈纤维细胞样；⑵随着年龄的增长，脂肪干细胞的增殖能力呈下降趋势；⑶P0代时，所有细胞均表达CD29、CD31、CD34、CD45和CD90，且随着年龄增加，表达呈下降趋势。传至P4代，CD34、CD45逐渐消失，CD31表达显著降低，CD29、CD90表达高于95%；⑷随着年龄的增长，脂肪干细胞的成脂、成骨分化潜能均呈下降趋势。结论 低年龄的脂肪干细胞可能具备更好的临床应用潜能。

脂肪干细胞； 生物学特性； 增殖能力； 分化潜能

脂肪干细胞辅助自体脂肪移植被公认为是一种安全有效的移植方法。利用自体脂肪干细胞辅助脂肪组织移植，可能成为医学美容领域的最佳方案，并因此逐渐成为当前新的研究热点之一[1-3]。多项研究提示，随着年龄的增加，人体中干细胞在数量和生物学活性方面呈下降趋势[4-5]。然而，不同年龄的女性脂肪干细胞生物学特性以及分化潜能等方面是否存在显著差异，目前尚未完全证实。自2013 年12 月至 2014年 8月，笔者探索不同年龄女性脂肪干细胞在细胞形态、体外增殖能力、多种表面标志物表达和成脂、成骨分化潜能方面的差异，旨在为脂肪干细胞在医学美容和抗衰老方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM/F12、胎牛血清(美国GIBCO公司)；Ⅰ型胶原酶、MTT、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤、油红O染料(美国SIGMA公司)；CD29、CD31、CD34、CD45、CD90抗体(美国EBIOSCIENCE公司)。

1.2 样本来源及分组 脂肪组织来源于在哈尔滨医科大学附属第一医院整形美容中心接受吸脂的22例女性，年龄19～48岁。其中，19～28岁(A组)8例；29～38岁(B组)8例；39～48岁(C组)6例。

1.3 脂肪干细胞的分离与培养 将脂肪组织用D-Hanks 冲洗，去除血液及其他残留组织。将脂肪组织倒入50 ml离心管，加入等体积0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃振荡消化4 h。1000 r/min离心15 min，弃上层脂滴和液体，沉淀过滤掉组织残渣，获得脂肪干细胞团，用基础培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清FBS)重悬后，接种于60 mm 的细胞培养皿中。37 ℃培养48 h，换液后，在光学显微镜下观察细胞形态。待细胞长满培养皿后，进行传代培养。

1.4 细胞增殖 取生长状态良好的P3代脂肪干细胞，接种于24孔板，初始细胞浓度为3×103/孔，加入含10% FBS的DMEM/F12培养，每日取3孔细胞消化、计数，取其均数，以时间(d)为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.5 流式细胞术检测 将脂肪干细胞用PBS洗涤2次，1500 r/min离心5 min；用100 μl PBS缓冲液稀释细胞，分别加入单克隆抗鼠抗人抗体CD29-PE、CD31-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、CD90-PE，4 ℃避光孵育30 min；用4 ml PBS重悬细胞，1500 r/min离心5 min，重复洗涤2遍，500 μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪测定。

1.6 成脂分化诱导及鉴定 将P4代的脂肪干细胞接种在6孔板中，待细胞融合至70%～80%，加入脂诱导培养基，对细胞进行成脂诱导分化。成脂诱导培养基的成分为DMEM/F12+10%FBS+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L IBMX+10 μg/ml 胰岛素+1×10-6mol/L 地塞米松。每3 d更换1次诱导培养基；诱导14 d后，弃培养基，用DPBS将细胞冲洗1遍；加入40%的油红O稀释液染色10 min；用75%乙醇冲洗1遍，再用蒸馏水洗1遍，光学显微镜下观察拍照。

1.7 成骨诱导分化及鉴定 将P4代的脂肪干细胞接种在6孔板中，融合至70%～80%，加入成骨诱导培养基，对细胞进行成骨诱导分化。成骨诱导培养基的成分为DMEM/F12+20%FBS+20 mmol/L β-甘油磷酸钠+50 μmol/L 维生素C+1×10-6mol/L 地塞米松。每3 d更换1次诱导培养基；诱导14 d后，弃培养基，用DPBS冲洗2遍；用4%多聚甲醛固定30 min，加入新鲜配制的碱性磷酸酶染液染色，待细胞着色明显时，弃染料，用DPBS冲洗2遍，光学显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 细胞形态 培养24 h后，多数细胞开始贴壁，其形态逐渐变为长梭形；培养7 d后，各组细胞均呈典型的成纤维样细胞形态，核椭圆，胞浆丰富，相互平行排列成束；传至P4代时，各组细胞形态仍保持稳定(图1)。

2.2 增殖能力 如图2所示，A组(19～28岁)细胞增殖能力最强，B组(29～38岁)细胞增殖能力次之，而C组(39～48岁)细胞增殖能力最弱。提示随着年龄的增长，脂肪干细胞的增殖能力逐渐降低。

2.3 免疫表型 分别比较各组P0代和P4代细胞的免疫表型，包括CD29、CD31、CD34、CD45、CD90。发现P0代时，各组均表达上述分子，且A组表达最高，而C组表达最低(表1)。随着传代次数的增加，到P4代时，造血干细胞标志CD34和CD45几乎消失，血管内皮标志CD31也显著降低，间充质干细胞标志CD29和CD90的表达均高于95%(表2)。

表1 各组P0代细胞表面标志物的表达

表2 各组P4代细胞表面标志物的表达

2.4 成脂分化潜能 如图3所示，诱导分化14d后，A组细胞明显转变为油红O染色阳性的脂肪细胞，B组中油红O染色阳性的脂肪细胞较少，而C组中油红O染色阳性的脂肪细胞最少。提示随着年龄的增长，脂肪干细胞成脂分化能力逐渐减弱。

2.5 成骨分化潜能 如图4所示，诱导分化14d后，A组细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性，而C组细胞碱性磷酸酶染色结果最弱。提示随着年龄的增长，脂肪干细胞成骨分化能力逐渐减弱。

图1 各组脂肪干细胞形态 (×100) 图2 各组脂肪干细胞增殖能力 图3 各组脂肪干细胞成脂分化潜能(油红O×200) 图4 各组脂肪干细胞成骨分化潜能(碱性磷酸酶染色 ×200)
Fig 1 ADSCs form in each group (×100). Fig 2 Proliferation of ADSCs in each group. Fig 3 Adipogenic differentiation potential of ADSCs in each group (oil red O ×200). Fig 4 Osteogenic differentiation potential of ADSCs in each group (alkaline phosphatase staining ×200).

3 讨论

脂肪是人体来源最丰富的组织[2]。2001年，Zuk等[6]首次从脂肪组织中分离培养得到一种具有多向分化潜能的干细胞，因其与骨髓间充质干细胞形态相似，故称为脂肪间充质干细胞。近年来的研究表明，脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能，是一种理想的种子细胞[7]。目前，脂肪干细胞的获得，通常是通过脂肪抽吸术等方式，不会对人体产生明显的不良后果。不仅如此，脂肪干细胞在体外的增殖速度快，且不需要特殊的血清，不必进行永久化处理，就能获得足够的细胞用于移植。目前，以脂肪干细胞作为种子细胞的脂肪组织工程有望在乳房再造术、除皱术及凹陷畸形矫正术中发挥作用[1]。

之前有研究提示，不同年龄的脂肪干细胞表现出一定的差异性[8-9]。本研究发现，随着女性年龄的增长，其与造血干细胞、间充质干细胞及内皮祖细胞相关的表面标志物的表达，均呈下降趋势，且成脂、成骨分化能力逐渐下降。在原代培养时，我们发现，所有细胞均表达CD29、CD31、CD34、CD45和CD90。其中，CD29和CD90为脂肪间充质干细胞的表面标志物，CD34、CD45则主要表达于造血干细胞，而CD31通常表达于血管内皮和内皮祖细胞[10-12]。可见，获取的原代细胞是一群由多种干细胞、祖细胞及成熟细胞组成的混合细胞。尽管如此，我们仍然发现，随着年龄的增加，各类干祖细胞标志物的表达均呈显著下降趋势，提示年龄是影响人体脂肪干细胞含量的重要因素。在利用现有培养体系将细胞培养至第4代时，造血干细胞标志物CD34和CD45逐渐消失，而细胞主要表达间充质干细胞标志物CD29和CD90，提示该培养体系更适合脂肪间充质干细胞的生存，有助于纯化和批量扩增脂肪间充质干细胞。

成脂和成骨是脂肪间充质干细胞最重要的分化潜能，直接决定了脂肪干细胞在临床整形方面的应用价值[13]。在本研究中，我们利用纯化后的脂肪间充质干细胞分别进行成脂和成骨诱导分化，发现随着女性年龄的增长，脂肪间充质干细胞的成脂、成骨分化潜能均呈显著下降趋势。上述结果提示，年龄是影响脂肪间充质干细胞进行组织器官修复和再生的重要因素。

总之，本研究表明，随着女性年龄的增长，其脂肪干细胞的含量及多向分化潜能均显著下调。提示在应用脂肪干细胞进行医学整形美容时，应将年龄作为重要参考因素。此外，在相对年轻时保存自体脂肪干细胞，以备将来所需，是一个好的选择。

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Comparison of biological characteristics of adipose derived stem cells in female at different ages

LIUYang,SHANGYong,LIZhuo,etal.

(CenterofPlasticandAestheticSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective To explore the differences of the morphology, surface marker expression, growth characteristics, and differentiation potential of adipose stem cells obtained from females at different ages (19～48 years old). Methods The adipose tissues from females at different ages were harvested and adipose-derived stem cells were separated. Cell morphology was observed and cell proliferation was compared. Cell immunophenotypes were detected using flow cytometry. Adipogenic and osteogenic differentiation were induced. Results ⑴ All adipose-derived stem cells were fibroblast-like.⑵ The proliferation capacity of the adipose-derived stem cells was decreased with the increasing of the age. ⑶ The expression of CD29, CD31, CD34, CD45 and CD90 in all cells at passage 0 (P0) were positive and decreased with the increasing of the age. At P4, the expressions of CD34 and CD45 were gradually disappeared, with CD31 significantly decreased, while the CD29 and CD90 expressions were higher than 95%, respectively. ⑷ With the increasing of the age, their adipogenic and osteogenic differentiation potentials were decreased. Conclusion Adipose-derived stem cells from female at low age show better potentials for clinical application.

Adipose stem cell; Biological characteristics; Proliferation; Differentiation potential

150001 黑龙江 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第一医院 整形美容中心

刘 洋(1983-)，男，黑龙江哈尔滨人，主治医师，硕士.

郝立君,150001,哈尔滨医科大学附属第一医院 整形美容中心,电子信箱：lijunhao368@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.06.019

R318

A

1673-7040(2015)06-0372-04

2015-01-22)