王海珍， 戴婷婷， 崔春晓， 周淑彦， 蒋朝华， 窦红静

葡聚糖-聚丙烯酸荧光纳米凝胶用于皮肤淋巴管显影的研究

王海珍， 戴婷婷， 崔春晓， 周淑彦， 蒋朝华， 窦红静

目的 探讨葡聚糖-聚丙烯酸荧光纳米凝胶用于皮肤微淋巴管显影的可行性和生物安全性。方法 应用葡聚糖和聚丙烯酸为原料，合成荧光纳米凝胶，采用扫描电镜和纳米粒度电位分析仪测定其表征。注入小鼠趾蹼皮下，在荧光显微镜下观查小鼠下肢皮肤淋巴管走行和分布。1个月后，取其肝脏、肾脏、脾脏及心脏，进行HE染色病理组织学检查，验证其是否具有生物安全性。结果 葡聚糖和聚丙烯酸通过自组装一步法合成了荧光纳米凝胶，控制其粒径约为180 nm，皮下注射能够被皮肤淋巴管吸收，并清晰准确地显示和定位皮肤淋巴管，示踪出皮肤淋巴管的走行和分布。组织学分析证实，远期未发现重要组织器官的病损。结论 葡聚糖-聚丙烯酸荧光纳米凝胶能够应用于皮肤淋巴管的显影，可以清晰地示踪皮肤淋巴管的走行和分布，并具有生物安全性。

荧光纳米凝胶； 淋巴管； 淋巴造影； 生物安全性

皮肤淋巴管参与了众多疾病的病理过程，对皮肤淋巴管的研究有助于阐明其在淋巴管相关疾病病理过程中的作用机制[1]。因此，通过示踪皮肤淋巴管来研究皮肤淋巴管的走行和分布特征具有十分重要的临床意义。选择合适的造影剂是皮肤淋巴管成像的关键[2]。近年来，荧光纳米凝胶由于其生物亲和性良好，粒径适中而开始应用于生物显影[3-4]。葡聚糖-聚丙烯酸荧光纳米凝胶(fluorescent dextran-based nanogels， FDNG)是由葡聚糖和聚丙烯酸按照一步法自组装的方式合成的大分子荧光纳米凝胶[3,5]。这种大分子凝胶因其合适的粒径，高荧光强度和生物亲和性，已成功用于脂肪间充质干细胞的示踪显影[6]和前哨淋巴结的示踪，但能否应用于皮肤淋巴管显影，尚未见文献报道。笔者通过用FDNG注射小鼠趾蹼皮下研究小鼠下肢皮肤淋巴管的走行分布，探讨其应用于皮肤淋巴管显影的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 C57小鼠，由上海斯莱克实验动物中心提供；葡聚糖(dextran，分子量40 000)分析纯(analytical reagent, AR)、丙烯酸(acrylic acid，AA)，国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸镁(干燥过夜经减压蒸馏提纯后使用)；5-氨基荧光素(Fluoresceinamine，isomer Ⅰ， 5-AF)，美国SIGMA公司；10%水合氯醛,深圳市腾龙源实业有限公司；倒置相差显微镜(TS-100型)、荧光显微镜,日本OLYMPUS公司；数码照相机(DXM-1200),日本NIKON公司。

1.2 葡聚糖-聚丙烯荧光纳米凝胶的制备 FDNG由葡聚糖-聚丙烯纳米凝胶(dextran-based nanogels，DNG)与荧光介质5-AF采用自组装一步法合成(由上海交通大学材料学院提供)。具体合成方法如下：取25 ml葡萄糖的储备液，用注射器加入一定量的引发剂硝酸铈铵，5 min后用微量进样器加入反应单体丙烯酸，30 min后再加入交联剂亚甲基双丙烯酸酰胺；反应结束后，制备得到DNG；再通过酰胺缩合反应将带有氨基的5-AF偶联到DNG上，从而得到FDNG[3,5,7]，见图1。

1.3 材料的表征 ⑴FDNG的形态观察。纳米凝胶经磷钨酸负染后，通过透射电子显微镜观察形态。将1 mg/ml纳米凝胶的水溶液滴加在附有碳膜的铜网上，干燥后，用2%的磷钨酸溶液(pH 6.0)染色2 h，用滤纸吸去染液，透射电子显微镜观察。⑵FDNG粒径的测量。纳米凝胶的流体力学直径及分布，通过动态光散射法在纳米微粒电位分析仪(Malvern Zetasizer Nano ZS90)上测量获得。除非特别指出，所有测定均在25 ℃下水溶液中进行，测定浓度为1 mg/ml。所有结果均为至少3次测定结果的平均值。

1.4 活体小鼠皮肤微淋巴管显影 小鼠经腹腔注射10%水合氯醛(5 ml/kg)麻醉后，使用脱毛膏将其下肢毛发脱去。经后爪皮下注射FDNG(1 mg/ml， 20 μl)，轻揉注射部位片刻，置荧光显微镜下观察，对其下肢皮肤的微淋巴管通路进行原位成像。

1.5 生物安全性评估 在C57小鼠注射FDNG进行皮肤微淋巴管显影1个月后，将小鼠用过量CO2气体麻醉处死，对其解剖，取其肝脏、肾脏、脾脏和心脏，用4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋等。对上述器官进行HE染色，观察其形态学和组织学的改变。

2 结果

2.1 FDNG的表征 经过5-AF修饰的DNG的粒径分布仍然较窄，PDI在0.2左右，粒径较未经荧光修饰的纳米凝胶粒径稍大，扫描电镜检测脱水后的粒径为30～50 nm；动态光散射检测DNG粒径约为113 nm，FDNG的粒径约为180 nm(图2)。

2.2 活体小鼠皮肤微淋巴管显影 小鼠下肢趾蹼皮下注射FDNG后，发现FDNG能够被皮下淋巴系统迅速吸收并进入下肢微淋巴管循环，在荧光显微镜下，活体小鼠的下肢皮肤中清晰地显示出真皮微淋巴管的走向和分布(图3)。

2.3 体内生物安全性评估 小鼠注射FDNG 1个月后，对肝脏、肾脏、脾脏和心脏进行组织学检测，未发现形态学和病理学的改变(图4)。

3 讨论

对皮肤淋巴管的研究，近年来一直进展缓慢，很大程度上可能因为缺乏理想的淋巴管显影手段。皮肤淋巴管的走行分布、收纳范围和回流淋巴结等问题，国内外均鲜有报道。有文献报道利用淋巴管内皮特异性免疫组化染色标记淋巴管的方法[7-9]，可以精确标记淋巴管。但是该方法对于观察单张切片和小范围情况下的淋巴管有效，而且工序繁多，无法连续观察，且大体情况下无法辨认淋巴管，因此不适用于观察皮肤整体淋巴管走行和分布特征。亚甲蓝直接淋巴管造影法，因其必须暴露在解剖视野中，限制了其应用[10]；同位素淋巴管影像学造影方法因为存在放射污染有一定的局限性[11]。目前，对于皮肤淋巴管的分布走行特征缺乏有效的观察方法。因此，有必要找到一种合适的方法，既能准确判断是否为淋巴管，又能准确定位皮肤淋巴管的位置，且能够观察皮肤淋巴管整体分布和走行及其回流情况等。

一般认为，一种好的淋巴管示踪剂应该具备：⑴对淋巴组织的特异性；⑵被淋巴组织吸收快，并能清楚地显示出淋巴管；⑶在淋巴管中能够滞留较长时间；⑷成本低，无毒性。本实验采用的纳米凝胶是由物理或者化学交联的聚合物网络组成的水凝胶颗粒[12]，它是一种纳米尺度的水分散体，水中稳定性高[13]，而且采用葡聚糖和聚丙烯酸制备，原料价格低廉，成本低，生物相容性好，毒性小，接载荧光素后荧光强度高，利于在荧光显微镜下观测[14]。由于其粒径可控，我们合成后将其粒径控制在180 nm左右，使其满足只进入淋巴管而不进入血管的条件，因此，将其注入趾蹼皮下后，FDNG能够只走行于淋巴管中，而不会与血管混淆，我们可以在荧光显微镜下清晰准确地观测活体小鼠下肢皮肤中淋巴管的走行和分布。基于以上几点，我们证明了FDNG可以用于皮肤淋巴管的显影，示踪皮肤淋巴管的走行和分布。但是，若应用于临床，还需要生物安全性的保证。因此，我们对小鼠皮下注射FDNG1个月后，对其肝脏、肾脏、脾脏和心脏进行组织学的检测，HE染色证实，重要器官并未发生形态学和组织学的改变，表明FDNG在体内不会引起远期的器官损害，从一定程度上阐明了应用的生物安全性。

图1 FDNG的制备 图2 FDNG的表征 a.FDNG的扫描电镜图像 b.DNG和FDNG的粒径分布 图3 小鼠下肢皮肤微淋巴管的活体成像 a. 荧光显微镜下小鼠下肢皮肤成像 b. 荧光显微镜下小鼠下肢皮肤微淋巴管影像(绿色荧光所示) 图4 小鼠体内注射FDNG1个月后肝脏、肾脏、脾脏和心脏的形态学和组织学变化(HE ×100)

Fig 1 Prepare of FDNG. Fig 2 Exosyndromes of FDNG. a. transmission electron microscopy images of FDNG. b. size distributions of DNG and FDNG. Fig 3 Images of micro lymphatic vessels in mouse lower extremity skins after injection of FDNG in vivo. a. images of lower extremity skin under fluorescence microscope. b. images of micro lymphatic vessels of the skin under fluorescence microscope (green). Fig 4 Histological and morphological changes of liver, kidney, spleen, and heart at 1 month after FDNG injection (HE ×100).

综上所述，使用荧光纳米凝胶示踪法研究皮肤淋巴管的走行和分布，将为皮肤病理生理研究提供一种有效的检测手段。虽然荧光纳米凝胶作为淋巴示踪剂，体现出许多优势，但是在荧光成像的过程中，当受到激发光激发时，生物体部分其他物质会产生荧光，例如皮肤和毛发等。这些背景噪音造成荧光成像的灵敏度降低，因此，如何避免生物样品的背景荧光干扰，将成为我们今后实验中进一步深入探讨和研究的内容。

葡聚糖-聚丙烯荧光纳米凝胶具有合适的粒径，能够特异性示踪皮肤淋巴管的走行和分布，同时具有较好的生物安全性，为其临床应用提供了保证。

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Experimental research of dextran-polyacrylic acid fluorescent nanogel for skin lymphangiography

WANGHai-zhen,DAITing-ting,CUIChun-xiao,etal.

(DepartmentofDermatology,ShangqiuCentralHospital,Shangqiu476000,China)

Objective To investigate the feasibility and biosafety of fluorescent dextran-polyacrylic nanogels (FDNG) for the skin lymphangiograph. Methods Dextran and polyacrylic acid was used as raw material to synthesize fluorescent nanogel. The characteristics of FDNG were detected by Zetasizer Nano ZS90 and scan electronic microscope. FDNG was injected into subcutaeous of mouse toe web to observe the distribution and pattern of lymphatic vessels under fluorescence microscope. One month later, tissues of liver, kidney and heart tissue were harvested and examined by HE staining to testify whether there were pathological changes. Results The dextran-polyacrylic acid fluorescent nanogel was synthesized with dextran and polyacrylic acid by self-assembly one-step method, the synthesized particle diameters were around 180 nm. Pattern and distribution of skin lymphatic vessels could be clearly visualized after subcutaneous injection. The histological analysis showed that No pathological changes were found in important organs. Conclusion The dextran-polyacrylic acid fluorescent nanogel can clearly trace the distribution and pattern of skin lymphatic vessels with reliable biosafety.

Fluorescent nanogel; Lymphatic vessel; Lymphangiography; Biological safety

国家自然科学基金资助项目(81372080/21374061); 上海交通大学医学院附属第九人民医院基金资助项目(2013B02)

476000 河南 商丘，商丘市中心医院 皮肤科(王海珍);上海交通大学医学院附属第九人民医院 整形外科(戴婷婷,崔春晓,蒋朝华);上海交通大学 材料科学与工程学院金属基复合材料国家重点实验室(周淑彦,窦红静)

王海珍(1975-)，女，河南人，副主任医师，博士.

蒋朝华，200011，上海交通大学医学院附属第九人民医院 整形外科，电子信箱：zhhjiang@163.com；窦红静，200240，上海交通大学 材料科学与工程学院金属基复合材料国家重点实验室，电子信箱：hjdou@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.06.020

R446

A

1673-7040(2015)06-0375-04

2015-03-17)