胡辅华，许玉俊，刘丽林，季 建，于荣国，李筱荣

（1.天津港口医院眼科 300456；2.天津港口医院急诊科 300456；3.天津市第五中心医院眼科 300456；4.天津医科大学眼科医院眼科 300074）

随着我国经济水平和国民消费水平的提高，人民的饮食方式发生了改变，糖尿病的发病率也逐年增加［1］。糖尿病视网膜病变是糖尿病的并发症之一，是糖尿病微血管病变的重要表现，是一种特异性的眼底改变，可严重影响患者的视力及生活质量，眼底镜下表现为新生血管的广泛形成［2］。糖尿病视网膜病变的形成机制较为复杂，主要为血管内皮生长因子（VEGF）刺激内皮细胞增生和新生血管形成，这一过程与机体的氧化应激反应相关［3－4］。α－硫辛酸（α－lipoic acid，α－LA）是一种作用较强的抗氧化剂，可以有效清除自由基，从而发挥其作用［5］。本次研究应用72只Wistar大鼠作为研究对象，观察α－LA对糖尿病视网膜病变大鼠VEGF表达的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用72只健康的雄性Wistar大鼠作为实验材料，体质量为200～220g，平均（210.4±6.2）g，由天津医科大学实验动物中心提供，合格证号14－0212。将72只大鼠分为4组：空白对照组（A组）12只，糖尿病模型组（B组）24只，α－LA治疗组（C组）24只，葡萄糖干预组（D组）12只。

1.1.2 药物 α－LA注射液（南京新百药业有限公司，批号20131107），链脲佐菌素（STZ，Sigma公司，纯度大于98.0%），0.5%硫酸阿托品滴眼液（Alcon Labratories Inc，批号：20140103）。

1.2 方法

1.2.1 模型构建及药物处理 所有大鼠均进行适应性喂养1周，B和C组大鼠按照60mg／kg的剂量腹腔注射STZ（溶于0.1mol／L的柠檬酸缓冲液，pH＝4.5），72h后采大鼠尾静脉血测空腹血糖，血糖大于或等于16.7mmol／L为糖尿病模型构建成功；A组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液。4组大鼠均进行常规饲养，C组大鼠每天下午3：00用100mg／kg的α－LA灌胃；A组和B组大鼠于同一时刻用等量的生理盐水灌胃，D组同一时间用等量的5.0%葡萄糖溶液灌胃。于4、8、12周分别测量各组生存大鼠的体质量和胰岛素抵抗。胰岛素抵抗：采用7170A全自动生化检测仪检测大鼠的空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS），计算稳态胰岛素抵抗指数（HOMA－IR）。HOMA－IR＝FINS×FPG／22.5。比较各组大鼠的FPG、FINS和 HOMA－IR。

1.2.2 大鼠视网膜VEGF的表达 于4、8、12周分别从A组和D组随机挑选4只大鼠，B和C组各随机挑选8只大鼠，观察视网膜的VEGF的表达，标本的制备方法如下：用10.0%的水合氯醛麻醉大鼠并在无菌条件下处死，摘取大鼠眼球，切除眼球前节，于显微镜下撕取大鼠的视网膜组织。组织切片用二甲苯脱蜡后用乙醇进行梯度水化，将切片放于柠檬酸缓冲液（10mL，pH＝6.0）微波修复抗原5min。用3.0%的过氧化氢处理切片，清除过氧化物酶活性。将一抗滴注在处理好的切片上，室温下静置60min；用PBS冲洗切片，滴加二抗后在37℃水浴1h。兔抗鼠VEGF单克隆抗体（一抗，即用型）羊抗兔抗体（二抗，即用型）均由上海我武生物科技有限公司提供。用PBS冲洗切片后用二氨基联苯胺（DAB）溶液染色，之后用苏木精进行复染、切片脱水后封存。所有样本均分别进行2次染色和制片，显微镜下观察染色结果。免疫组织化学染色的评分结果［6］如下：0分，阴性（－），组织染色结果为阴性或仅有不到5.0%的细胞着色；1分，弱阳性（＋），5.0%～＜25.0%的细胞出现中等及以下的染色；2分，阳性（＋＋），25.0%～50.0%的细胞出现中等程度的染色或10.0%～50.0%的细胞出现较强的染色；3分，强阳性（＋＋＋），超过50.0%的细胞出现较强程度的染色。

1.2.3 大鼠血清超氧化钠歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和IL－6的检测 大鼠在处死前经颈静脉取血2mL，置于抗凝试管中，分离血清。SOD检测采用氮蓝四唑（NBT）法，试剂盒由碧云天生物科技有限公司提供；GSH和IL－6检测均采用ELISA检测，试剂盒由上海信裕生物科技有限公司提供。

1.2.4 眼底检查 第12周末，B～D组大鼠在处死前进行眼底检查：大鼠滴注0.5%硫酸阿托品滴眼液进行散瞳后，在眼底镜下观察大鼠的视网膜新生血管的形成，评价标准如下［7］：Ⅰ期表现为视网膜有微动脉瘤或存在小出血点；Ⅱ期表现为视网膜存在黄白色“硬性渗出”有或无出血斑；Ⅲ期表现为视网膜出现白色“软性渗出”，伴或不伴有出血斑，上述Ⅳ～Ⅵ为单纯型糖疾病视网膜病变。Ⅳ期表现为视网膜出现新生血管，伴或不伴有玻璃体出血；Ⅴ期为眼底检查出现新生血管和纤维增生；Ⅵ期为在Ⅴ期的基础上出现视网膜脱落，上述Ⅳ～Ⅵ为增殖型糖疾病视网膜病变。

1.3 统计学处理 使用SPSS15.0软件进行数据处理，计量资料以表示，组间比较运用单因素方差分析，等级资料采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 糖尿病大鼠的模型构建情况 72h后，B～D组大鼠模型构建成功，B组大鼠FPG为（21.72±4.28）mmol／L，C组为（21.54±4.96）mmol／L，D组为（21.83±4.77）mmol／L，差异无统计学意义（P＞0.05）；A组大鼠FPG为（4.57±0.15）mmol／L，与B、C、D组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。A组大鼠体质量（210.5±5.2）g，B组（211.2±5.7）g，C 组（209.8±5.8）g，D组（208.7±3.4）g，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠体质量和胰岛素抵抗的变化 不同时刻各组大鼠的体质量、FPG、FINS和 HOMA－IR差异有统计学意义（P＜0.05）。C组大鼠不同时刻的体质量、FPG、FINS和 HOMA－IR差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量和FPG的变化（）

表1 各组大鼠体质量和FPG的变化（）

a：P＜0.05，大鼠不同时刻观察指标相互比较。

HOMA－IR 4时间 体质量（g） FPG（mmol／L） FINs（μU／mL）周A组 264.4±16.24.56±0.12 17.8±1.5 3.56±0.37 B组 225.7±9.821.56±4.52 25.7±2.6 4.65±0.47 C组 245.9±11.4a17.61±3.25a 18.2±1.7 3.92±0.39a D组 207.8±11.426.17±4.82 27.2±2.8 5.62±0.828周A组 275.6±17.84.67±0.23 17.6±1.4 3.54±0.32 B组 235.6±11.223.44±4.67 25.5±2.7 4.67±0.52 C组 259.8±13.5a15.42±1.34a 18.5±1.4 3.88±0.35a D组 220.7±8.528.82±2.77 27.5±2.9 5.67±0.7912周A组 289.8±23.54.58±0.17 17.9±1.6 3.64±0.38a B组 255.7±13.124.79±4.12 25.8±2.9 4.72±0.48 C组 268.7±16.5a12.81±0.97a 18.7±1.8 3.98±0.38 D组234.6±11.727.87±3.97 27.8±2.5 5.65±0.81

2.3 各组大鼠的SOD、GSH和IL－6水平变化 不同时刻的各组大鼠的SOD、GSH和IL－6水平具有统计学差异（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠的SOD、GSH和IL－6水平变化（）

表2 各组大鼠的SOD、GSH和IL－6水平变化（）

VEGF 4时间 SOD（U／L） GSH（mmol／L）IL－6（ng／L）周A组 120.9±8.917.2±2.55.2±0.50.2±0.1 B组 72.5±2.611.7±0.97.7±0.82.3±0.4 C组 89.7±3.513.7±0.86.4±0.51.7±0.3a D组 67.5±1.7 9.9±0.67.9±0.62.7±0.1a 8周

续表2 各组大鼠的SOD、GSH和IL－6水平变化（）

续表2 各组大鼠的SOD、GSH和IL－6水平变化（）

a：P＜0.05，大鼠不同时刻的观察指标相互比较。－：此项无数据。

时间 SOD（U／L） GSH（mmol／L）IL－6（ng／L）120.4±11.217.1±1.95.1±0.60.1±0.1 B组 74.6±3.1 11.4±1.08.4±1.02.7±0.3 C组 98.7±2.9 14.5±1.16.2±0.31.5±0.2a D组 65.9±1.2 10.0±0.59.1±0.92.9±0.2a 12周A组 121.5±7.9 17.8±1.75.4±0.60.3±0.1 B组 73.6±2.8 11.5±0.98.5±0.92.8±0.5 C组 109.5±3.7 15.9±1.25.9±0.7 －D组VEGF A组55.9±1.6 10.1±0.410.2±1.5 －

2.4 各组大鼠的VEGF免疫组织化学染色评分 不同时刻的各组大鼠免疫组织化学染色评分差异有统计学意义（P＜0.05），C组和D组大鼠不同时刻的免疫组织化学染色评分差异有统计学意义（Z＝7.342，P＜0.05）。见表2。

2.5 糖尿病大鼠的眼底检查结果 12周末，B、C、D组大鼠的眼底镜检查GR分期结果差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同GR分期糖尿病大鼠的眼底检查结果（n）

3 讨 论

随着生活水平的提高和饮食结构的改变，我国糖尿病的发生率逐渐提高，给我国的医疗卫生事业带了极大的负担。糖尿病患者可出现多种并发症，其中糖尿病视网膜病变是糖尿病微血管病变的最典型表现之一，可分为单纯型和增殖型，后者引起失明的可能性更大，增殖型突出表现为视网膜新生血管和纤维组织的形成，部分患者甚至出现视网膜的脱落，患者可出现视力的严重下降甚至失明［8］。

研究发现，糖尿病患者视网膜新生血管形成与视网膜组织中VEGF的表达和对血管内皮细胞的诱导作用密切相关，上述过程与糖尿病患者的氧化应激反应密切相关。因此作为一种多功能的强效抗氧化剂，α－LA在糖尿病视网膜病变的防治中具有一定的应用价值［9］。本次研究中，应用72只 Wistar大鼠作为研究对象，观察α－LA对糖尿病大鼠的视网膜病变和VEGF表达的影响。

实验应用STZ腹腔注射的方法构建糖尿病视网膜病变的大鼠模型，STZ是一种DNA烷基化试剂，对胰腺的胰岛β－细胞具较强的细胞毒性。STZ可以诱发多种动物的糖尿病模型，多用于大鼠和小鼠的糖尿病模型构建［10］。经过72h后，B～D组大鼠出现明显的高血糖，说明大鼠的糖尿病模型构建成功。

糖尿病视网膜病变发生的机制较为复杂，涉及多种因素的共同作用，糖尿病患者高血糖、血脂代谢异常和炎性反应共同作用，可以导致机体出现一系列的病理生理变化，包括内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）活性的下降和一氧化氮的合成减少，血管内皮损伤和氧化应激的［11］。α－LA可以有效清除机体代谢差的活性氧物质及自由基、抑制脂质过氧化反应并改善eNOS活性，减轻血管内皮的损伤。同时，α－LA的应用可以改善机体的胰岛素抵抗，发挥降血糖的作用［12］。本次研究中，C组患者的HOMA－IR明显低于B组和D组。

与A组大鼠相比，B～D组的大鼠的SOD、GSH水平明显降低，说明糖尿病的体内存在较强的氧化应激反应；C组大鼠不同时刻的SOD活性和GSH水平均明显高于B组，高于D组，且随着时间的推移呈上升趋势，说明α－LA可以有效清除大鼠体内的氧化活性物质。C组视网膜组织VEGF表达水平较D组降低，说明α－LA可以抑制VEGF蛋白在视网膜上的表达，干预早期糖尿病视网膜病变的发生、发展。比较各组大鼠的IL－6水平，不同时刻C组的炎性反应程度低于B、D组。

大量研究发现，糖尿病视网膜病变患者视网膜的VEGF表达水平升高［13］，高血糖可以激活蛋白激酶C介导的信号传导通路从而活化NADPH氧化酶，激活的NADPH氧化酶可以直接诱导活性氧的产生并上调VEGF的表达水平［14］；同时，高血糖的刺激可以导致视网膜微小血管的损伤，导致供血供氧的不足，缺氧状态可促进VEGF的表达和新生血管的形成［15］。

综上所述，α－AL的应用可以有效抑制大鼠视网膜VEGF的表达，这一作用可能与改善胰岛素抵抗、抑制慢性炎症和氧化应激多个环节相关。同时，研究中，C组α－AL治疗大鼠的VEGF水平仍轻微高于A组健康大鼠，提示糖尿病视网膜病变可能与多个环节调控相关。

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