覃裕旺，王庆高，朱智德，卢健棋，王振常，凌芸（.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 500；.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 500；.广西中医药大学附属护理学院，广西 南宁 500）

化痰活血益心方对压力负荷性心肌肥厚大鼠AngⅡ，Trx的影响

覃裕旺1，王庆高1，朱智德2，卢健棋1，王振常1，凌芸3
（1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 530023；3.广西中医药大学附属护理学院，广西 南宁 530023）

摘要：［目的］研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），硫氧还蛋白（Trx）在大鼠压力负荷性心肌肥厚中的表达及化痰活血益心方的干预作用。［方法］采用部分缩窄腹主动脉方法制作大鼠压力负荷性心肌肥厚模型，模型对照组造模不给药，中药组（大、中及常规剂量组）造模2周后给予化痰活血益心方（10倍常规剂量、5倍常规剂量及常规剂量，常规剂量为0.12 g/kg），卡托普利组造模2周后给予卡托普利6.75 mg/kg，每日灌胃1次，共4周。观察各组大鼠心肌AngⅡ，Trx的含量。［结果］与模型对照组比较，中药大、中、常规剂量组及卡托普利组均能显著降低压力负荷性大鼠心肌AngⅡ含量（P＜0.01），中药大剂量组、卡托普利组降低AngⅡ与中药常规剂量、中剂量组比较，差异有显著性意义（P＜0.01或P＜0.05）。各组心肌Trx蛋白表达比较，与模型对照组比较，中药大、中、常规剂量组及卡托普利组Trx蛋白明显增加（P＜0.01），中药大剂量组Trx蛋白表达与中药中、常规剂量组比较，差异有显著性意义（P＜0.01）。［结论］化痰活血益心方能通过升高Trx及降低AngⅡ发挥抗氧化应激损伤作用，且化痰活血益心方大剂量升高Trx及降低AngⅡ作用更显著。

关键词：化痰活血益心方；心肌肥厚；AngⅡ；Trx；实验研究

心肌肥厚的发生发展过程与氧化应激有着密切的联系。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是调控心血管系统稳定性的重要神经体液因子，可作为一种内在的氧化剂促使氧化应激的发生，在高血压、糖尿病等疾病的心脏损害中发挥重要作用［1］。硫氧还蛋白（Trx）是机体重要的小分子蛋白质，与体内细胞氧化还原反应、核酸代谢、细胞生长及肿瘤发生有关，在组织的抗氧化负荷反应中起重要的作用［2］。笔者采用部分缩窄腹主动脉方法制作大鼠心肌肥厚模型，观察AngⅡ，Trx在大鼠心肌肥厚模型中的表达及化痰活血益心方的干预作用，以进一步阐明氧化应激在心肌肥厚中的作用机制及化痰活血益心方的作用机理。

1　实验材料

1.1动物选用清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体重220～250g，由广西医科大学医学实验动物中心提供，合格证号: SCXK桂2003-0003。

1.2药物化痰活血益心方（组方:陈皮15g，法半夏10g，茯苓15g，党参30g，生姜6g，丹参10g，川芎10g，桂枝10g，砂仁6g，炙甘草10g等），由广西中医药大学第一附属医院药房提供，经干燥、称重、浸泡、煎煮3次，浓缩留存。

1.3试剂AngⅡ测试盒购自上海拜力生物科技有限公司；Trx一抗（CST）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）；RIPA裂解液（武汉博士德生物技术有限公司）。

2　方法

2.1大鼠心肌肥厚造模方法采用部分缩窄腹主动脉方法造模［3］1698。以30 mg/kg的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，将大鼠仰卧位固定于鼠板，剪去术野皮毛，皮肤消毒后行腹正中切口，切开皮肤及肌层，暴露内脏，将大鼠胃及其肠系膜等推向右侧，暴露肾脏及脊柱前的腹主动脉，在肾动脉分支上方分离腹主动脉约1 cm长，用7号注射器针头紧贴腹主动脉，平行放置，并将两者一起结扎，然后抽出注射器针头，即可部分缩窄腹主动脉。术后每天用青霉素（5万单位/只）腹腔注射，连续7天。3～4天大鼠心肌即开始肥厚，2～3周达稳定高峰。

2.2分组及给药取Wistar大鼠50只进行造模，另取10只大鼠为空白组。造模大鼠随机分为模型对照组，中药大、中、常规剂量组，卡托普利组，每组10只。空白组:正常饲养。模型对照组:造模2周后灌胃等量生理盐水，每日灌胃1次，共4周。中药常规剂量组:造模2周后给予化痰活血益心方，灌胃量按《药理实验方法学》［3］864进行换算，每100 g大鼠每日给药量为12 mg。每日灌胃1次，共4周。中药中剂量组:造模2周后给予化痰活血益心方，给予5倍常规剂量。每日灌胃1次，共4周。中药大剂量组:造模2周后给予化痰活血益心方，给予10倍常规剂量。每日灌胃1次，共4周。卡托普利组:造模2周后给予卡托普利，每100 g大鼠每日给药量为0.675 mg，每日灌胃1次，共4周。

2.3AngⅡ含量检测（ELISA法）按照试剂盒内说明书进行检测。实验结束后，迅速从大鼠心脏将左心室分离出，置于在-80℃冰箱保存备用。检测时将心肌组织匀浆，3000 g离心10 min，取上清液测定心肌组织AngⅡ的含量。

2.4Trx及内参β-actin蛋白检测（Western blot法）取大鼠左心室组织，置于预先加有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中，剪碎，匀浆，提取总蛋白，用BCA法测总蛋白浓度。每个标本取含有30μg蛋白的样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，一抗过夜，洗膜，二抗孵育，然后对膜进行化学发光，X光片显影，采用Image J1.48v图像分析软件对X光片中的目的蛋白及β-actin的条带进行灰度分析，用目的蛋白和β-actin的灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达含量。

3　结果

3.1各组心肌AngⅡ含量比较与模型对照组比较，中药大、中、常规剂量组及卡托普利组均能显著降低压力负荷性大鼠心肌AngⅡ含量（P＜0.01），中药大剂量组、卡托普利组降低AngⅡ与中药常规剂量、中剂量组比较，差异有显著性意义（P＜0.01或P＜0.05）。中药大剂量组与卡托普利组在降低AngⅡ含量差异无显著性意义（P＞0.05）。见表1。

表1　各组心肌AngⅡ含量比较（ng/L±s）

表1　各组心肌AngⅡ含量比较（ng/L±s）

注:与模型对照组比较，①P＜0.01；与空白组比较，②P＜0.05，③P＜0.01；与卡托普利组比较，④P＜0.05，⑤P＞0.05；与中药常规剂量组比较，⑥P＞0.05，⑦P＜0.01；与中药中剂量组比较，⑧P＜0.01

组别　n　AngⅡ空白组　10　37.68±10.04①模型对照组　10　124.38±23.09卡托普利组　10　61.24±17.61①②中药常规剂量组　10　84.55±20.32①③④中药中剂量组　10　79.28±13.64①③④⑥中药大剂量组　10　54.79±18.03①②⑤⑦⑧

3.2各组心肌Trx蛋白表达比较与模型对照组比较，中药大、中、常规剂量组及卡托普利组Trx蛋白明显增加（P＜0.01），中药大剂量组Trx蛋白表达与中、常规剂量组比较，差异有显著性意义（P＜0.01）。见图1。

图1　各组心肌Trx蛋白表达

4　讨论

AngⅡ一方面能通过氧化应激途径引起心肌肥大，另一方面AngⅡ又可促进ROS生成，进而活化相应信号转导通路，调控心肌细胞肥大及凋亡［4-5］。Nakagam等［6］用AngⅡ诱导新生鼠心肌细胞肥大，研究发现肥厚反应由O2¯·介导，抗氧化剂能减轻氧化应激，所有反应可被血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）阻断剂所阻断。提示AngⅡ与AT1R结合后，可激活NADPH氧化酶产生O2¯·。

Trx蛋白是机体抗氧化防御系统的主要部分，是维持细胞内氧化还原稳态的第一线还原系统。其抗氧化作用表现在两个方面［7］:①直接或作为某些过氧化物酶的电子供体清除氧自由基；②作为细胞内硫基还原酶，还原多种蛋白质的二硫键，使其恢复生理功能。Trx蛋白对细胞功能具有广泛的调节作用，其中之一便是抑制心肌肥大，因此被认为是治疗心肌肥大的理想靶点。Yanfei Yang等［8］实验发现AngⅡ可上调Trx1，Trx1的高表达又上调了miR-98的转录，而miR-98能显著抑制心肌肥大，说明Trx蛋白能够逆转AngⅡ诱导的心肌肥大。在原发性高血压患者中，GSH（谷胱甘肽过氧化物酶）系统无论在血浆还是单核细胞中均降低；相反Trx呈增高趋势。Trx过度表达可削弱AngⅡ诱导超氧阴离子和H2O2产生，显著减少Nox2（NADPH氧化酶胞膜相关亚单位）、p47 phox（Nox胞浆亚单位）和Rac（三磷酸鸟嘌呤核苷结合蛋白）的表达［9］。

本课题组前期研究结果表明，化痰活血益心方具有显著降低压力负荷性大鼠全心重量指数、左心室重量指数，说明化痰活血益心方具有抗心肌肥厚的作用［10］。本次研究结果显示，与模型对照组比较，中药大、中、常规剂量组及卡托普利组均能显著降低压力负荷性大鼠心肌AngⅡ含量（P＜0.01），中药大剂量组、卡托普利组降低AngⅡ的含量与中药常规剂量、中剂量组比较，差异有显著性意义（P＜0.01或P＜0.05）。中药大剂量组与卡托普利组在降低AngⅡ含量方面差异无显著性意义（P＞0.05）。说明化痰活血益心方具有抗AngⅡ的作用，且与剂量有一定关系。模型对照组Trx蛋白表达低，中药大、中、常规剂量组及卡托普利组Trx蛋白明显增加（P＜0.01），大剂量组Trx蛋白表达高于中、常规剂量组（P＜0.01）。说明化痰活血益心方能通过升高Trx及降低AngⅡ发挥抗氧化应激损伤作用，从而抑制氧化应激途径引起的心肌肥大。化痰活血益心方抗氧化应激损伤作用与剂量有一定关系，其机制有待进一步研究。

参考文献

［1］顾玉梅.氧化应激在心肌肥厚中的作用及其机制［J］.南通大学学报:医学版，2005，25（3）:233～封3.

［2］Powis G，Montfort W R.Properties and biological activities of thioredoxins［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2001，41: 261-295.

［3］魏伟，吴希美，李元建.药理实验方法学［M］.4版.北京:人民卫生出版社，2010.

［4］Hingtgen S D，Tian X，Yang J，et al.Nox2-containing NADPH oxidase and Akt activation play a key role in angiotensinⅡinduced cardiomyocyte Hypertrophy［J］.Physiol Genomics，2006，26（3）:180-191.

［5］Cheng T H，Shi N L，Chen C H，et al.Role of mitogen activated protein kinase patliway in reactive oxygen species mediated endothelin-1-induced beta-myosin heavy chain gene expreslion and cardiomyocyte liypertropliy［J］.J Biomed Sci，2005，12（1）:123-133.

［6］Nakagam I H，Takemoto M，Liao J K.NADPH oxidase derived superoxide anion mediates angiotensinⅡinduced cardiac hypertrophy［J］.J Mol Cell Cardiol，2003，35（7）:851.

［7］Koharvova M，Kolarova M.Oxidative stress and thioredoxin system［J］.Gen Physiol Biophys，2008，27（2）:71-74.

［8］Yanfei Yang，Tetsuro Ago，Peiyong Zhai，et al.Thioredoxin 1 Negatively Regulates AngiotensinⅡ-Induced Cardiac Hypertrophy through Upregulation of miR-98/let-7［J］.Circ Res，2011，108（3）:305-313.

［9］杨峥，姚超永.氧化应激与高血压［J］.中国动脉硬化杂志，2011，19（5）:455-458.

［10］覃裕旺，朱智德，王庆高，等.化痰活血益心方对大鼠压力负荷性心肌肥厚氧化应激的影响［J］.广西中医药大学学报，2015，18（1）:6-8.

（编辑陈明伟）

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：2095-4441（2015）02-0006-03

收稿日期:2015-04-25

基金项目:广西自然科学基金（编号:2010GXNSFA013212）

作者简介:覃裕旺（1969-），副主任医师，研究方向:中西医结合防治心血管疾病的基础与临床研究

通信作者:朱智德