林锦何，叶翰江

（惠州市惠阳区水果生产办公室,广东 惠州516211）

芒果POD基因片段的克隆及序列分析

林锦何，叶翰江

（惠州市惠阳区水果生产办公室,广东 惠州516211）

摘要：通过改进的热硼酸法提取“Keitt”品种芒果果皮中的RNA,以提取的RNA为模板进行逆转录为cDNA，并以此为模板设计POD基因简并引物,进行RT-PCR,得到的扩增产物经纯化后与PMD-18载体连接,转化大肠杆菌,任意挑选阳性克隆,进行序列分析,得到芒果POD基因特异片段.通过DNA-Star软件对几种亲源关系较近的物种进行氨基酸序列同源性比对,芒果POD基因与柑桔、龙眼、可可、梨的POD基因的相似性分别为：89%、87%、88%、77%,说明克隆得到的片段为芒果POD基因片段.

关键词：芒果；POD基因；cDNA克隆；序列分析

芒果（Mangifera indica L.）为漆树科芒果属热带常绿果树,原产印度及马来西亚等地区,在我国主要集中分布于海南、广东、广西、云南等南方省区.芒果由于果实味道甜美、风味独特而深受人们喜爱.芒果作为跃变型热带亚热带水果,采收期正值高温多雨季节,不仅会加速采后果实的完熟,而且也极易使采后果实受病原微生物的侵染导致腐烂,降低其耐贮性,造成较大损耗［1］.

过氧化物酶（Peroxidase,POD）基因是植物次生代谢物质合成的关键基因［2］,在植物木质素和木栓质的合成［3-5］、参与生长素的降解［6］、参与活性氧代谢［7］、参与植物组织褐变、参与植物对外界不良胁迫的应答［8-12］等过程中,具有许多非常重要的生理功能［13］.目前对芒果POD基因的克隆国内尚未有相关的报道,为此,笔者通过克隆芒果POD基因,对其序列进行了分析并与柑桔、龙眼、梨等水果进行氨基酸序列同源性比对,为进一步研究其在芒果中的相关研究奠定了研究基础.

1　材料与方法

1.1供试材料

从云南省华坪县采摘凯特品种芒果.选取果实大小均匀,没有机械伤害或病症的果实,用清洗剂将芒果洗干净晾干取芒果果皮为样品,将样品用液态氮冷冻后保存在 -80°C冰箱.

1.2提取芒果总RNA及mRNA的分离纯化

提取芒果总RNA的方法为热硼酸法,基本参照 Wan和 Wi1kins（1994）［14-15］的方法.mRNA的分离纯化按TaKaRa Agarose Ge1DNA Purification kit试剂盒的说明书进行.

1.3检测mRNA浓度及完整性

用分光光度计检测芒果总RNA含量并评价其质量.取1μ1总芒果RNA,稀释 100倍,测定其在260、280 nm的光吸收值并计算OD 260/OD280的比值.为进一步评价芒果总RNA的完整性,取 10μg芒果总RNA在 1.2%浓度的琼脂糖变性胶进行电泳检测［16］.

1.4POD简并引物的设计与合成

根椐GenBank中植物的同源序列使用Primer 5.0软件设计POD （登录号∶EF122403；AF030132；AY301280；AF403707）基因的简并引物.上游引物序列为5,-YAYGATTTCACYGTBAAGGA-3,,下游引物序列为5,-AAYTTKCHRAAGTTCCACTT-3,,引物由上海生工生物工程有公司合成.

1.5芒果cDNA克隆与序列分析

以提取的芒果mRNA为模板［17］,采用TaKaRa PrimeScriPtⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录合成第一链cDNA,用该cDNA作为模板与POD基因的简并引物作RT-PCR［18］.RT-PCR条件为∶94℃预变性3 min,共计32个循环（94℃变性30 sec、Tm退火30 sec、72℃延伸1 min）的反应,72℃延伸10 min.RT-PCR产物经1%琼脂凝胶电泳后,切下目的片段,用DNA凝胶回收试剂盒（Agarose Ge1DNA Purification Kit,TaKaRa）进行回收,回收方法基本参照TaKaRa试剂盒说明书上的步骤进行［19］.经回收纯化后与TaKaRa PMD-18载体连接、转化进DH5α大肠杆菌中.在LB/AMP/IPTG/X-Ga1平板上进行阳性克隆筛选,最后随机挑取经EcoRⅠ/HindⅢ酶切确认的已插入目的基因质粒作序列分析［20］.序列分析委托上海生工生物技术有限公司完成,采用美国ABI337序列分析仪.

2　结果与分析

2.1总RNA的制备

本实验提取的芒果总RNA纯度高、质量好,无明显的降解,用紫外分光光度计检测芒果总RNA的紫外吸收值A260/280比值约为1.80,1%琼脂糖变性凝胶电泳结果清楚显示18 S和28 S两条核糖体RNA带,并且没有明显拖尾现象（图1所示）,说明提取的RNA,完全可用于基因克隆和半定量RTPCR等后续实验.

图1　芒果果皮总RNA电泳检测

2.2RT-PCR产物的扩增

以合成的cDNA第一链为模板,以POD基因的简并引物为引物,进行PCR扩增POD cDNA片段, PCR产物经过含有GDview的1%琼脂糖凝胶电泳,在紫外凝胶成像仪下观察.图2（a）表明泳道1在365 bP左右处有一条明亮条带,这条条带与预计的POD PCR产物的大小基本一致.对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳、回收并琼脂糖凝胶电泳回收检测,在365 bP左右可以清楚的看到回收条带.将回收的扩增片段用于下一步与载体连接、转化.在含有LB/AmP/IPTG/X-Ga1培养基上筛选出阳性克隆,并在蓝斑周围挑选白色的菌落进行LB液体培养［21］,抽提质粒,用EcorRⅠ/HindⅢ 进行双酶切和凝胶电泳检测,结果如图2（b）所示,在泳道1、2可以清楚的看到大小365 bP左右的条带.

图2　芒果电泳图

2.3序列分析与同源性比较

测序结果显示,该序列由365个碱基组成（图3,Genebank登录号为GU266282）,该核苷酸序列编码121个氨基酸,通过DNA-Star软件对氨基酸序列同源性比较发现,芒果POD基因与柑桔、龙眼、可可、梨［22］的POD基因的相似性分别为∶89%、87%、88%、77%（图4）.通过物种间基因序列相似性比对结果表明此克隆得到的目的片段为芒果POD基因片段.

图3　扩增片段测序结果

图4　芒果POD基因氨基酸序列与柑桔、龙眼、可可、梨的POD基因氨基酸序列的同源性比较

3　讨论

芒果果皮由于富含酚类等物质,这给RNA的提取及定量分析带来了极大困难.经过改进的Wan等的热硼法可尽可能的去除果皮中的多酚类物质,为提取高质量的芒果总RNA提供了可能［23］.本试验提取的芒果果皮总RNA含量较高,经紫外分光光度计检测OD260/OD280＞1.8,而且RNA琼脂糖凝胶变性电泳后18 S和28 S两条核糖体RNA带清晰可见,可满足cDNA克隆及RNA定量分析的要求.

已知POD在植株体内广泛存在,参与植物抗病性作用,该酶能在细胞壁中催化酚类前体聚合形成木质素作为抵御病菌侵袭屏障［24］,其活性的增加,标志着植物抗病物质的加速合成和植物抗性的产生［25］；另外它也是细胞内活性氧清除酶之一,可避免活性氧的产生和积累［26］.为此,本研究通过cDNA克隆出芒果POD基因,通过与柑桔、龙眼、可可、梨已确定为其POD基因进行序列同源性比对,它们的相似性分别为∶89%、87%、88%、77%,此证明克隆得到的片段为芒果POD基因片段,从同源性比对结果来看这几种植物中编码的氨基酸序列具有较高的同源性而且区域间的相似性高度集中,从另一个侧面也表明这几种物种间也有较近的亲源关系.POD基因特异片段的获得为进一步在分子水平上研究其在芒果中的相关功能、作用并且在研究物种间的进化关系有着非常重要的意义.

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（责任编辑∶闫文龙）

中图分类号：S667.7

文献标识码：A

文章编号：1007-5348（2015）10-0053-05

［收稿日期］2015-05-28

［基金项目］韶关市科技计划项目（2013CX/N09）.

［作者简介］林锦何（1985-）,男,广东汕头人,惠州市惠阳区水果生道办公室农艺师,硕士；研究方向∶果树生理、分子生物学.

Clonlng and Sequence Analysls of POD Genes ln M a ngo

LIN Jin-he,YE Han-jiang
（Huizhou City Huiyang District Fruit Production Office,Huizhou 516211,Guangdong,China）

Abstract:The study using modified hot boric acid method extracted RNA from the Pee1 of“Keitt”mango. Using PCR degenerate Primers designed with reference to the conserved amino acid sequences of known POD genes,it was to amP1ify cDNA fragments in mango fruits by RT-PCR.The Purified Product was connected with PMD-18 vector and transformed into E.co1i.The random1y se1ected Positive c1ones were Performed with sequence ana1ysis,to achieve mango sPecific fragments of mango POD gene.The homo1ogy of amino acid sequence was found through DNA-Star software,the simi1arity of mango POD gene with citrus, 1ongan,cocoa and Pear was 89%,87%,88%,77%,resPective1y.

Key words:Mango；POD Genes；cDNA c1oning；sequence ana1ysis