冯 莉 王贵英 (河北医科大学第四医院肿瘤内科，河北 石家庄 0500)

结直肠癌好发于中老年人群，近年发病率及病死率呈上升趋势〔1〕。以手术为主，化疗、放疗为辅的综合治疗方案是目前结直肠癌有效的治疗方法，而氟尿嘧啶(5-Fu)为结直肠癌患者化疗重要药物，因此患者对于5-Fu敏感性可影响其预后〔2〕。化疗在杀灭正常癌细胞的同时会损伤正常细胞组织，导致患者出现各种副反应。老年结直肠癌患者由于机体功能衰退，对化疗耐受性较差，从而影响其治疗效果。因此化疗前正常评估患者对化疗方案的敏感性及对毒副反应的耐受性将有助于促进患者预后。胸苷酸合成酶(TS)是增殖期细胞所必需蛋白质，是DNA合成反应中的重要酶类〔3〕。近年研究指出〔4〕，TS表达水平与肿瘤的发生、进展及化疗敏感性有密切关系。本研究探讨老年结直肠癌患者肿瘤组织中TS阳性表达情况及其与5-Fu敏感性、副反应及预后的关系。

1 资料及方法

1.1 一般资料 2012年6月至2014年6月78例确诊为结直肠癌老年患者，纳入标准:①经病理组织学确诊为结直肠癌;②参照美国癌症联合委员会(AJCC)分期(第7版)为Ⅲ～Ⅳ期;③卡氏(KPS)评分≥70分;④术前经腹部CT或B超检查排除远处转移;⑤术后均应用5-Fu为主的化疗方案。排除标准:合并恶性肿瘤史或临床资料不全患者。其中男45例，女33例;年龄62～75岁，平均(66.3±3.8)岁。病理类型:高分化 24例，中分化24例，低分化30例。临床分期:Ⅲ期38例，Ⅳ期40例。浸润程度:T1 19例，T2 12例，T3 30例，T4 17例。

1.2 免疫组化法

1.2.1 主要试剂 内源性过氧化物酶(北京康为世纪生物科技有限公司);TS单克隆抗体(即用型，购于北京中衫金桥公司);辣根过氧化物酶(上海朗瑞精细化学品有限公司)。

1.2.2 步骤 调取本院病理科中保存完整的标本蜡块，重新切片采用SP法进行免疫组化染色。具体操作如下:将标本蜡块切成4 μm厚切片，于室温下采用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。应用3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，以0.01 mol/L PBS冲洗2次。采用正常羊血清工作液封闭样本10 min，加入鼠抗人TS单克隆抗体，并采用PBS冲洗2次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素工作液，于37℃下孵育25 min，采用PBS液冲洗2次，经DAB染色，苏木素复染，采用中性树胶封固。

1.2.3 结果判断 根据病理切片染色面积及深度对结果进行评分。染色深度评分:0分显色不清或不显色;1分土黄色;2分棕黄色;3分褐黄色。染色面积:0分0%且≤5%，1分为＞5%且≤35%，2分＞35%～65%;3分＞65%。染色深度与面积相加/2则为平均分，其中1分(+)为0.5～1;2分()为1.5～2.0;3分()为2.5～3.0。

1.3 4、5-二甲基噻唑-2(MTT)法检测敏感性

1.3.1 主要试剂 0.9%氯化钠溶液(广州百特医疗用品有限公司);0.25%胰蛋白酶消化液(北京纽因华信科技发展有限公司);苔盼蓝(北京中生瑞泰科技有限公司)。

1.3.2 实验步骤及结果判断 取肿瘤组织约1 g，采用0.9%氯化钠溶液漂洗2次，剪碎肿瘤，加入0.25%胰蛋白酶消化液，经200目滤筛过滤，并制成单细胞悬浮液。采用苔盼蓝染色计算活细胞，并采用完全培养液将细胞浓度调整为5×105/ml，并将细胞接种于96孔板中，每孔100 μl。将孔板分为实验组、对照组、空白组，实验组中加入5-Fu，20 μl/孔，对照组加入等量培养液，空白组不加入细胞悬浮液，只加入PBS。将培养板置于37℃、5%CO2环境中培养48 h，并于每个培养孔中加入20 μl MTT，继续培养4 h，弃去上清液，并加入150 μl二甲基亚矾(DMSO)，轻轻震荡充分摇匀，并采用酶标仪测定各孔光密度(OD)值，并计算抑制率(CI)。当CI≥30%为敏感，CI＜30%为不敏感。

1.4 疗效评价 ①近期疗效:根据实体瘤疗效评价标准(RECIST标准)进行疗效评价，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、病情稳定(SD)、疾病进展(PD)。其中CR+PR为总有效率(RR)。②化疗毒副反应:参照世界卫生组织(WHO)抗癌药物急性及亚急性毒性分级0～Ⅳ度。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行χ2检验。

2 结果

2.1 TS在结直肠癌中的表达情况 结直肠癌组织中TS阳性表达率〔74.36%(58/78)〕显著高于正常癌旁组织〔10.26%(8/78)〕(χ2=7.852，P=0.002)。

2.2 TS阳性表达与临床病理特征的关系 TS表达与结直肠癌患者淋巴结转移、阳性淋巴结数、分化程度、浸润程度有关(P＜0.01)，而与性别、年龄、肿瘤分型、肿瘤大小、TNM分期无关(P ＞0.05)，见表1。

表1 TS阳性表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.3 TS阳性表达与不良反应的关系 TS阳性表达患者恶心呕吐、骨髓抑制、腹泻、口腔黏膜炎化疗毒副反应等级显著高于TS阴性患者(P＜0.01)，见表2。

表2 TS阳性表达与不良反应的关系(n)

2.4 TS阳性表达与近期化疗效果及敏感率的关系 患者均顺利完成化疗，TS阳性表达患者化疗总有效率、化疗敏感率显著高于TS阴性患者(P＜0.05)，见表3。

表3 TS阳性表达与近期化疗效果及敏感率的关系〔n(%)〕

3 讨论

TS是胸苷酸合成限速酶，通过抑制TS生成能有效抑制DNA的生物合成，从而抑制细胞生长及增殖〔5〕。5-Fu可通过抑制TS生成而发挥抗癌活性，TS被认为是5-Fu及其衍生物杀灭癌细胞的靶点〔6〕。本研究提示TS表达水平升高与结直肠癌的发生具有密切关系。Negri等〔7〕检测了接受5-Fu化疗后发生转移的大肠癌患者TS表达水平，结果发现TS水平与生存期呈负相关(P＜0.05)。本研究进一步论证了TS表达水平可作为临床结直肠癌患者化疗药物选择的评价指标。

尽管5-Fu是结直肠癌化疗中首选的药物，但由于个体差异，并不是所有患者都对5-Fu敏感，不同个体间存在显著差异，甚至个别病例可发生血液学毒性及致死性消化道不良反应〔8〕。张婷婷等〔9〕应用DNA芯片对5-Fu耐药的癌细胞株进行分析发现TS过度表达。任建林等〔10〕对5-Fu类药物作用机制进行研究时发现，TP不仅是5-Fu及其前体药物的催化酶，同时还具有促进肿瘤血管生成的作用，TS在肿瘤组织侵犯转移过程中起到重要的作用。本研究提示TS过度表达可影响5-Fu类药物化疗敏感率，从而影响患者治疗效果。这可能与如下因素有关:①TS高表达可促进肿瘤细胞内DNA合成，从而加速肿瘤细胞增殖，加速患者病情进展。②TS作为5-Fu类药物的关键靶点，其表达水平增高，表明该靶点对化疗的敏感性下降，产生了耐药性，因此化疗效果较差。

本研究结果与何琼等〔11〕及Avallone等〔12〕研究结果一致，研究结果均表明T分期或M分期越高的患者的患者，TS mRNA的表达水平越高。由于TS与血小板内皮细胞生长因子属于同一类物质，具有促进血管内皮细胞区划移动来刺激血管生成的作用。TS表达水平增加表面血管生长及侵袭性更强，患者恶性程度更高，因此通过测定肿瘤TS中的表达水平可有效预测结直肠癌患者病情进展及恶性情况。5-Fu在体内可被二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)转化生成5-氟二氢尿嘧啶排出体外，而TS可抑制DPD表达水平，当TS活性及表达水平增加时可影响DPD合成，降低DPD活性，使得血浆中5-Fu不能及时排出体外，导致5-Fu在血浆中大量蓄积，从而引起患者出现胃肠道及血液毒性，增加患者毒副反应〔13〕。本研究表明TS表达水平与5-Fu毒副反应有密切的关系。可根据TS与5-Fu化疗敏感性及毒副反应情况，在毒副反应中应筛选出TS阳性表达患者，并调整5-Fu化疗方案及剂量，从而提高患者化疗效果。

综上，TS高表达水平与直肠癌发生及病情进展具有密切的关系。直肠癌组织中TS表达可作为患者化疗敏感性、化疗副反应及预后的评价指标。

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