程兆宇，房磊（.吉林电子信息职业技术学院，吉林吉林30；.吉林农业科技学院，吉林吉林30）

富硒茶树菇的硒提取工艺及抗疲劳效果研究

程兆宇1，房磊2
（1.吉林电子信息职业技术学院，吉林吉林132021；2.吉林农业科技学院，吉林吉林132101）

摘要：为了探讨富硒茶树菇中硒的提取工艺以及抗疲劳功效，通过单因素试验确定富硒茶树菇中硒的提取工艺：提取次数2次，提取时间7 h，碱液浓度0.075mol/L，提取温度60℃，料液比1∶20（g/mL）。在此基础上，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析法，根据回归分析确定各工艺的影响因子，以提取所得硒含量为响应值作响应面和等值线图，确定富硒茶树菇中硒的最佳提取工艺条件为：碱液浓度为0.073mol/L，提取时间为6.91 h，提取料液比为1∶24.9（g/mL），在此工艺基础上，预测茶树菇的硒含量为22.82μg/g。此外，对含硒溶液的抗疲劳作用进行了研究，得到结果：硒能显著提高小鼠的生命力，增强其耐力，延迟感觉疲劳的时间。

关键词：富硒茶树菇；硒；抗疲劳；耐力

茶树菇（Agrocybe cylindracea），又名茶薪菇、杨树菇、柱状田头菇等，为层菌纲粪锈伞科田菌属真菌，被人们称为“菇中珍品”[1]。集高蛋白，低脂肪，低糖份，保健食疗于一身的纯天然无公害保健食用菌，具有很高的食用价值和药用价值[2-3]。经过优化改良的茶树菇，盖嫩柄脆，味纯清香，口感极佳，可烹制成各种美味佳肴，其营养价值超过香菇等其他食用菌，属高档食用菌

硒作为动物及人体的必需微量元素，含量仅20mg左右，其生物功能广泛，参与构成的硒蛋白和硒酶可作用于心脏、血细胞、骨骼肌和线粒体等多个方面，直接与人体健康密切相关，从而影响着人体的运动能力[5-7]。大量研究表明，硒可以对抗运动训练所致的氧化伤害[8]；改善运动所致的免疫机能下降[9]。相关调查表明，我国部分运动员的血清硒水平明显偏低，除年龄、性别等混杂因素，运动训练造成的影响是最关键的[10]，故人体营养元素硒的补充是十分必要的，因此硒势必会成为人们研究的焦点。

硒在水果中的生理活性及硒含量的测定，今后也是研究的重点方向[11-13]，此外在灵芝中的研究也较多[14-15]。在食用菌方面，田敏爵等对富硒猴头菇的含硒蛋白的提取工艺进行了研究[16]，王连芳则是对硒蛋白的提取工艺的优化进行了研究[17]，姚敏等研究指出蛋白硒是硒的主要赋存形态，占总硒的73.6%～77.4%，核酸和多糖结合硒量甚少，在蛋白质组份中，以碱溶性蛋白质结合硒量最高，占总硒的23.0%～25.2%[18]。

本文探讨茶树菇中的硒提取工艺，响应面进行了优化，并对其抗疲劳作用进行了讨论，为茶树菇在运动营养的开发和应用提供理论参考。

1　材料和方法

1.1材料和试剂

盐酸：西陇化工股份有限公司；氢氧化钾、硼氢化钾、铁氰化钾：广州友联化学试剂厂；硒标准储备液（质量浓度为1.000 g/L）、硒标准应用液（质量浓度为0.001 g/L）：安徽宇宁科技有限公司。

健康的昆明雄性小鼠，体重18 g～21 g，由长春应化所提供，合格证号：沪动合证字155号。生长环境温度20℃～25℃，相对湿度50%～70%。

1.2设备与仪器

FA1004A分析天平：上海达平仪器有限公司；LXJ离心沉淀机：上海精密科学仪器有限公司；AFS-230E原子荧光分光光度计：北京阳光亿事达有限公司；80-1电动离心机：金坛市科希仪器有限公司；JJ-2型均质机：苏州江东精密仪器有限公司；恒温游泳箱：北京阳光亿事达有限公司。

1.3提取工艺和测定方法

富硒茶树菇→组织粉碎→添加KOH搅拌→加热提取→冷却→添加盐酸和铁氯酸钾溶液→离心分离

采用（GB 5009.93-2010《食品安全国家标准食品中硒的测定》）原子荧光分光光度计自动测试。测试条件为负高压：300V；灯电流：80mA；原子化温度：80℃；炉高：8mm；载气流速：400L/min；屏蔽气流速：1000mL/min；测量方式：标准曲线法；读数方式：峰面积；延迟时间：0.1 s；读数时间：10 s；加液时间：8 s；进样体积：2m L[18]。

1.4标准曲线绘制

标准曲线的配制：分别取0.00、0.10、0.20、0.30、 0.40、0.50、0.60mL标准应用液于15mL比色管中，用亚沸水定容至10.0mL，再分别加浓盐酸2.0mL，铁氰化钾1.00mL，混匀，制成标准曲线。上机测定，记录数显示荧光值，绘制标准曲线，标准曲线见图1。

图1标准曲线Fig.1　Standard curve

1.5样品的测定

设定好仪器最佳条件，在试样参数画面，输入以下参数：试样质量（g或mL），稀释体积（m L），并选择结果的浓度单位，逐步将炉温升至所需温度后，稳定10 min～20min后开始测量。

连续用标准系列的零管进样，待读数稳定之后，转入标准系列测量，绘制标准曲线.在转入试样测定之前，再进入空白值测量状态，用试样空白消化液进样，让仪器取其均值作为的空白值，随后对试样进行测量。

1.6小鼠抗疲劳实验：游泳负重实验

设计10只小鼠为实验对象，组间的实验小鼠体重经t检验无显著性差异。空白对照组及低、中、高3个剂量硒溶液的实验组，其中低、中、高剂量组分别按人体摄入量的5、10、30倍，即12.5、25、75 m L/（kg· bw），空白对照组按相同体积纯净水进行灌胃，实验连续30 d。实验设计：小鼠尾根负重，重量为体重的5%，末次给药30 min，将小鼠至于水深30 cm、水温（25±0.5）℃的游泳箱中，记录从游泳开始至死亡的时间（min），作为小鼠的游泳时间[19]。

1.7统计分析

数据用X±SD表示应用SPSS统计软件进行数据分析，方差分析采用ANOVA，多重比较采用Duncan’s法。

2　结果与讨论

2.1影响硒提取的单因素分析

2.1.1浸提次数的影响

一次碱提不能将所有硒溶出，多次进行浸提是十分必要的。将一次浸提之后的残渣，用第一次浸提相同浓度的碱液，搅拌、离心、取上清液，重复上述过程，进行第3次，第4次硒的提取，结果如图2所示。

图2　提取次数的选择Fig.2　Extraction timesof choice

如图2可知，浸提2次后，能有效的将硒充分提出，2次后，浸提结果差异不显著，残渣基本不含硒，故确定浸提次数为2次为宜。

2.1.2浸提时间的影响

分别选择提取时间5、6、7、8、9 h进行试验，提取所得硒含量结果如图3。

图3　提取时间的选择Fig.3　Selectextraction time

由图3可知，随浸提时间的延长，提取出的硒含量不断提高，但7 h后，提取率的增长趋势趋于平缓，故选择7 h为最佳硒提取时间。

2.1.3碱液浓度的影响

分别选取 0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mol/L的碱液进行提取，所得硒含量结果如图4所示。

图4 提取碱液浓度的选择Fig.4　Extraction alkaliconcentration of choice

由图4可知，碱溶液浓度增加，浸提出的硒含量增加，碱浓度小于0.075mol/L时，变化幅度较大，后变化趋势趋于平缓，变化不显著，故选择0.075mol/L为浸提时碱液浓度。

2.1.4温度的影响

分别选取50、60、70、80、90℃进行提取，所得硒含量结果如图5所示。

图5 提取温度的选择Fig.5　Extraction temperature selection

由图5可知，随着温度的升高，硒含量逐渐提高，提取效果越好，硒有一部分是以硒蛋白形式存在，其变性温度为70℃～80℃，故选择60℃为浸提温度。

2.1.5料液比的影响

分别选取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL）进行提取过程，所得硒含量结果如图6所示。

图6 提取料液比的选择Fig.6　Extractsolid-liquid ratio selection

由图6可知，随着料液比的增大，硒的含量越大，但料液比在1∶30（g/mL）后，变化趋于平缓，差异不显著，故选择1∶30（g/m L）为最佳料液比。

2.2响应面优化试验

2.2.1响应面优化试验结果

以提取次数、提取温度、提取时间、碱液浓度和料液比为单因素，确定最佳的提取工艺，以其试验结果为依据，采用响应面中心组合设计，以碱液浓度、提取时间和料液比为条件，以硒含量为响应值，研究其对富硒茶树菇中硒提取率的影响，每个因素设3个水平，因素水平表见表1。

表1　响应面优化因素水平表Table1　Factorsand levelsof Box-Behnken test

依据Box-Behnken试验设计方案，采用三因素三水平试验设计法进行工艺优化，其试验组合及结果如表2所示，方差分析显著性检验结果如表3所示。

表2　Box-Behnken试验设计及结果Table 2　Design and data from the Box-Behnken test

表3　试验结果回归分析Table 3　Regression nanlysis

据表2结果计算各项回归系数，以回归系数建立硒含量与碱液浓度A、提取时间B和料液比C 3个因子的数学回归模型，模型回归检验F=83.73，在0.01水平上差异极显著。失拟检验F=0.88，差异不显著，模型具有统计学意义。编码因素A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2差异显著，优化模型的编码方程为：Y=22.42-0.98 A-1.05 B+1.88 C-1.07 AB+1.62 AC+1.02 BC-2.31 A2-3.43 B2-2.52C2。

2.2.2响应面分析与优化

从回归系数的显著性检验结果可知，碱液浓度A和料液比C的互作效应对茶树菇硒含量的得率影响，根据二次回归方程绘制的响应面结果如图7所示。

图7　富硒茶树菇的提取响应面图Fig.7　Se-enriched Agrocybe cylindracea extracta response surface plot

从图7a可知，料液比一定时，在选定的条件范围内，提取效果较好的值都落在了碱液浓度和提取时间的中间区域。保持提取时间固定，硒含量随碱液浓度增加而增大，0.065mol/L～0.075mol/L时达最大值；保持碱液浓度固定，硒含量随提取时间延长而增大，在6 h～7 h时达到最大值。

从图7b可知，提取时间一定时，在选定的条件范围内，提取效果较好的值都落在了碱液浓度和料液比的中间区域。保持碱液浓度固定，茶树菇硒含量随料液比减小而增大，在1∶9.7（g/m L）～1∶25.3（g/m L）达最大值，之后逐渐减少；保持料液比固定，样品硒含量随碱液浓度增加而增大，0.068mol/L～0.072mol/L达最大值。

从图7c可知，碱液浓度一定时，在选定的条件范围内，提取效果较好的值都落在了提取时间和料液比的中间区域。保持提取时间固定，茶树菇硒含量随料液比减小而增大，在1∶19.4（g/mL）～1∶24.8（g/mL）达最大值；保持料液比固定，样品硒含量随提取时间延长而增加，6.7 h～7.1 h达到最高值。

结合回归模型的数学分析可知，茶树菇硒提取的最优工艺参数为碱液浓度为0.073mol/L，提取时间为6.91 h，提取料液比为1∶24.9（g/mL），在此工艺基础上，预测茶树菇的硒含量为22.82μg/g。为进一步检验响应面分析结果的可靠性，采用上述最优条件进行验证试验，实际测定样品硒含量为22.53μg/g，与理论值相比，误差较小，因此，采用响应面分析优化得到的提取条件参数准确可靠，可用于实际操作。

2.3提取物对小鼠负重游泳时间的影响

提取物对小鼠负重游泳时间的影响结果见表4。

表4　不同剂量硒溶液对小鼠体重及负重游泳时间的影响Table4　Effectsof extraetson thebodyweightand exhaustiue sw im times ofm ice

灌胃30 d后，小鼠的体重较初始时体重有所增加，各组之间不存在显著性差异（P＞0.05），所以硒提取物未影响小鼠的正常发育。相对于对照组低剂量组小鼠的负重游泳时间显著增加（P<0.05），中、高剂量组的负重游泳时间极显著增加（P<0.01），其中高剂量组小鼠负重游泳时间为31.6min，较对照组提高了将近3倍，如表4表明，茶树菇的含硒提取物能显著增强小鼠耐力。

3结论

通过单因素和响应面优化，得到富硒茶树菇的最佳提取工艺：茶树菇硒提取的最优工艺参数为碱液浓度为0.073mol/L，提取时间为6.91 h，提取料液比为1∶24.9（g/mL），在此工艺基础上，预测茶树菇的硒含量为22.82μg/g，实际测定值为22.53μg/g。在此基础上进行了硒溶液的抗疲劳实验，实验分析可知：硒溶液灌胃后不影响小鼠的正常生长状况；低、中、高3剂量均显著增加了小鼠的负重游泳时间，延缓了小鼠疲劳感的出现，增强其运动耐力。故茶树菇可成为运动营养食品的来源，下一阶段的工作是茶树菇运动食品的研发，为抗疲劳饮料或食品的开发和应用提供参考。

参考文献：

[1]李效贤,王芳芳,余陈欢,等.响应面分析法优化茶树菇多糖的提取工艺研究[J].食品研究与开发,2008,29(9):24-27

[2] 毛慧玲,束盈慧,杨文,等.茶树菇多糖提取工艺的优选[J].中药材,2007,30(2):217-220

[3]杨月明.茶树菇栽培技术[M].北京:金盾出版社,2001:2-3

[4]李会霞.茶树菇多糖提取工艺与生物活性关系的研究[D].福州:福建农林大学,2010:1-42

[5]袁艳红.硒与运动的关系[J].微量元素与健康研究,2008,25(1): 59-62

[6]王秀红.微量元素硒与人体健康[J].微量元素与健康研究,2006, 23(1):66-67

[7]熊正英,魏威,姚崇.硒的生物学功能与运动能力的关系综述[J].安康学院学报,2013,25(3):1-4

[8]Faure P.Protectiveeffects ofantioxidantmicronutrients(vitamin E, zinc and selenium)in type 2 diabetesmellitus[J].Clin Chem Lab Med,2003,41(8):995-998

[9]Beck MA,Levander OA,Handy J.Selenium deficiency and viral infection[J].JNutr,2003,133(1):1463-1467

[10]Edward DHarris.A Requirement for Copper in Angiogen2 esis[J]. Nutrition Reviews,2004,62(2):60-64

[11]刘兴艳.富硒功能保鲜剂在脐橙上的富硒效果研究[J].四川师范大学学报(自然科学版),2011,34(4):565-568

[12]刘兴艳,柏杉杉,张希.水果中硒含量的研究[J].四川师范大学学报(自然科学版),2010,33(4):526-528

[13]彭耀湘,陈正法.硒的生理功能及富硒水果的开发利用[J].农业现代化研究,2007,28(3):381-384

[14]赵镭,杜明,张美莉,等.硒在富硒灵芝中的分布[J].中国食品学报,2005,5(4):119-123

[15]高兴喜,姚强,杨润亚,等.野生灵芝的分子鉴定及富硒特性研究[J].中国酿造,2009,28(3):47-49

[16]田敏爵,李好.富硒猴头菌中含硒蛋白提取工艺研究[J].现代农业科技,2010,39(19):320-322

[17]王莲芳,窦春霞,张连富,等.富硒食用菌中硒蛋白提取工艺研究[J].食品与发酵工业,2007,33(1):122-126

[18]姚敏.富硒灵芝中硒含量分布和赋存形态研究[J].上海大学学报(自然科学版),1997,3(5):485-491

[19]黄清松,曾满红,李红枝,等.余甘子果汁饮料抗疲劳及抗衰老功效研究[J].南方农业学报,2014,45(5):840-843

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.21.009

作者简介：程兆宇（1982—），男（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：运动营养保健。类。茶树菇的研究主要其中在多糖的提取及应用[4]，富硒茶树菇硒的提取研究较少，如何经济有效的提取茶树菇的营养元素硒，可成为茶树菇的重点深入研究方向。

收稿日期：2014-12-03

Study on the Extraction Technology of Se-enriched Agrocybe Cylindracea and Anti-fatigue Effect

CHENG Zhao-yu1，FANG Lei2
（1.Jilin Collegeof Electronic Information，Jilin 132021，Jilin，China；2.Jilin Agriculture Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

Abstract：In order to study the extraction processof selenium in Se-enriched Agrocybe cylindracea and antifatigueeffect.The experimentdetermined the extraction processof Se in Se-enriched Agrocybe cylindraceabya single factor：extraction times was 2，extraction time was 7 h，lye solution was 0.075 mol/L，extraction temperaturewas60℃，and a solid-to-solvent ratiowas1∶20（g/m L）.Based on a single factor testusing three factors and three levels of response surface analysis to determine the impact of each factor based process regression analysis to extract the resulting value for the selenium content of the response and the response surface contourmap，to determine the optimum extraction conditions of Se in selenium Agrocybe cylindracea which the lye solution was 0.073 mol/L with a solid-to-solvent ratio was 1∶24.9（g/mL）for 6.91 h.The maximum predicted the selenium content under the optimized conditionswas 22.82μg/g.In addition，antifatigue effect of selenium solution were studied which showed the results：selenium could significantly improve thevitalityofmice，enhanced itsendurance，delayed timeof feeling tired.

Keywords：Se-enriched Agrocybe cylindracea；selenium；anti-fatigue；endurance