蒋伟 王夫景 康悦#

1哈尔滨工程大学医院内科，哈尔滨150001

2哈尔滨医科大学附属第二医院普外十科，哈尔滨150086

胃癌肿瘤微环境中Th17细胞的分布及临床意义△

蒋伟1王夫景2康悦2#

1哈尔滨工程大学医院内科，哈尔滨150001

2哈尔滨医科大学附属第二医院普外十科，哈尔滨150086

目的探讨随着肿瘤的进展胃癌肿瘤微环境中Th17细胞的分布及与患者预后、生存之间的关系。方法采用流式细胞术检测60例胃癌患者Th17细胞在不同时期的胃癌肿瘤微环境中的阳性表达率及分布。通过免疫组织化学染色验证120例胃癌患者Th17细胞的表达情况，并分析Th17细胞的表达与患者预后生存之间的关系。结果60例新鲜胃癌组织标本中，Th17细胞在肿瘤组织中的阳性表达率（10.3%±7.2%）高于癌旁正常胃组织（4.6%±2.5%），且组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。而进展期胃癌组织中Th17细胞的阳性表达率（8.7%±6.8%）显著低于早期胃癌组织（12.4%±7.6%），且组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。120例胃癌根治术后的组织标本中，Th17细胞高表达组5年生存率为58.7%，低表达组为40.4%，二者的差异有统计学意义（χ2=4.634，P=0.031）。结论胃癌肿瘤微环境中Th17细胞的表达与疾病的进展及患者的预后密切相关，可以作为预测胃癌患者术后生存的重要免疫指标。

Th17细胞；微环境；预后；胃癌

Oncol Prog,2015,13(4)

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，尽管早期检测、手术切除和辅助化疗在改善胃癌患者生存方面发挥了很大的作用，但大多数患者在就诊时已进入进展期，其5年生存率仅约20%[1]。肿瘤内免疫细胞的浸润和肿瘤的进展密切相关。随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展，从肿瘤免疫角度寻找胃癌肿瘤微环境中免疫调节的靶点，有希望成为胃癌治疗的新手段和策略，对开展胃癌的生物学治疗具有重要意义。本研究主要是通过检测Th17特征性标志物的表达情况来反映这种T细胞亚群在胃癌肿瘤微环境中的变化，并分析Th17细胞的表达对患者预后的影响，为胃癌的免疫治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取哈尔滨医科大学附属第二医院2012年7月至2013年10月间胃癌患者60例，对其肿瘤组织和癌旁正常胃组织（距离肿瘤组织5 cm以上）进行流式细胞检测。其中男性35例，女性25例，年龄在26～72岁，中位年龄为58.2岁。采用《美国癌症研究联合会癌症分期手册》（第7版，2010）进行TNM分期，其中早期胃癌（Ⅰ期）患者有25例，进展期胃癌（Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期）患者有35例。肿瘤组织和癌旁正常胃组织标本均在术中无菌条件下切取后立即进行单个核细胞悬液的分离。

选取哈尔滨医科大学附属第二医院2005年10月至2007年10月行根治性手术切除并经病理证实的胃癌患者120例，对其肿瘤组织和癌旁正常胃组织进行免疫组化染色。其中男性有73例，女性有47例，年龄为22～78岁，中位年龄为57.6岁。

所有患者临床病理资料完整，术前未经过放疗、化疗或生物治疗等抗肿瘤治疗，术后有完整的随访记录，排除自身免疫性及感染性疾病的患者。所有患者的死亡原因均为胃癌，生存时间为手术日至末次随访或死亡时间。

1.2 主要试剂

Anti-IL-17-PE购自美国Beckman Coulter公司；PMA、Ionomycin、BSA购自美国Sigma公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自上海国药集团化学试剂有限公司。兔抗人IL-17抗体、DAB显示试剂盒购于北京中山金桥生物技术有限公司。

1.3 流式细胞检测

新鲜组织取材后，用机械的方法得到单个核细胞悬液。然后加入4m l Ficoll淋巴细胞分离液至15 m l离心管中，取4 m l组织悬液缓慢加入到Ficoll层上，以2000 r/m in离心20m in。吸取中间的单个核细胞层对单个核细胞进行计数，并将其稀释到所需浓度用于Th17/CD4+淋巴细胞检测。加入抗IL-17-PE抗体后，上机进行流式检测。以CD4+IL-17+细胞代表Th17细胞，CD4+IL-17+/CD4+T细胞比例代表Th17细胞的阳性表达率。

1.4 免疫组织化学染色

组织蜡块进行4μm厚的连续切片，石蜡切片常规脱蜡后进行常规免疫组织化学染色（SP法），SP法染色时严格按试剂盒说明书操作，以PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：CD4+IL-17+细胞染色以胞质中的黄或棕色颗粒为阳性。每张切片连续计数5个不同高倍视野，按着色强度和细胞阳性率分别进行计分：①按着色强度计分：无着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②按细胞阳性率计分：≤10%为0分，11%～30%为1分，31%～50%为2分，51%～70%为3分，＞70%为4分；上述两项的得分相乘得到评分。两者乘积为0表示阴性（－），1～4为弱阳性（+），5～8为阳性（++），9～12为强阳性（+++）；（－）和（+）为低表达，（++）和（+++）为高表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。以均数±标准差（x-±s）表示计量资料数据。各组间均数的比较采用独立样本t检验。CD4+IL-17+细胞的表达与临床病理参数的关系采用χ2检验或Fisher确切概率法，5年生存率的计算应用Kaplan-Meier法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Th17细胞在胃癌肿瘤微环境中的分布

60例胃癌患者肿瘤组织和癌旁正常胃组织分别进行肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）和胃黏膜上皮内淋巴细胞（intra-epithelial lymphocytes，IEL）分离后，经流式细胞仪检测TIL和IEL中CD4+IL-17+细胞的分布（图1）。在肿瘤组织TIL中CD4+IL-17+细胞比例为（10.3%± 7.2%）（图1A），而癌旁正常胃黏膜IEL中CD4+IL-17+细胞比例为（4.6%±2.5%）（图1B），两组间细胞比例的差异有统计学意义（P＜0.05）。在早期胃癌患者肿瘤组织TIL中CD4+IL-17+细胞比例（12.4%±7.6%）较癌旁正常胃黏膜IEL中明显升高（5.1%±2.9%），且组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。进展期胃癌患者肿瘤组织TIL中CD4+IL-17+细胞比例（8.7%±6.8%）亦高于癌旁正常胃黏膜内IEL中的细胞比例（4.3%±2.1%），且组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。以上结果提示胃癌组织中CD4+IL-17+细胞更易在TIL中集聚，且在进展期胃癌组织中的细胞比例（8.7%±6.8%）显著低于其在早期胃癌组织中的细胞比例（12.4%±7.6%），组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。而早期和进展期胃癌的癌旁正常胃黏膜IEL中CD4+IL-17+细胞比例的差异无统计学意义[（5.1%±2.9%）vs（4.3%±2.1%），P＞0.05]。（图2）

图1 TIL和IEL中CD4+IL-17+细胞比例

图2 CD4+IL-17+细胞在胃癌不同分期的肿瘤微环境中分布的比较

2.2 CD4+IL-17+细胞的表达情况和患者生存之间的关系

采用免疫组织化学方法检测了120例患者的胃癌组织和癌旁正常胃组织中CD4+IL-17+细胞的原位表达。如图3所示，CD4+IL-17+棕黄色阳性颗粒定位于细胞质中。CD4+IL-17+细胞阳性率在胃癌肿瘤组织中高于癌旁正常胃组织，二者之间有显著性差异（χ2=8.213，P=0.004）。120例胃癌患者中，57例CD4+IL-17+细胞呈低表达，63例呈高表达。低表达组患者的5年生存率为40.4%，而高表达组的为58.7%，二者的差异有统计学意义（χ2= 4.634，P=0.031）（图4）。

图3 CD4+IL-17+细胞在胃癌组织及癌旁正常胃组织中的表达（SP染色，×400）

图4 CD4+IL-17+细胞的表达与胃癌患者生存的关系

3 讨论

机体的免疫系统在肿瘤发生和发展过程中，既可以通过建立有利于肿瘤细胞生长的肿瘤微环境来促进肿瘤的发展，又能通过抑制肿瘤细胞的增殖或破坏杀伤肿瘤细胞来控制肿瘤的生长。Th17细胞是近年来新发现的一种效应CD4+T细胞亚群，可特征性分泌IL-17因子，介导炎症反应，诱导血管形成和转录因子的激活[2]，参与多种自身免疫性疾病和癌症的发生发展[3]，并且与患者的不良预后有关[4]。

Th17细胞在人类肿瘤微环境中的分布已成为目前研究的热点[5-6]，在前列腺癌、多发骨髓瘤、口腔癌、膀胱癌和卵巢癌的TIL中均可观察到Th17细胞的集聚，并且大多数研究表明，其在肿瘤组织中的分布较高[7-8]。本研究结果表明，在胃癌TIL中CD4+IL-17+细胞比例为（10.3%±7.2%），癌旁正常胃黏膜TEL中CD4+IL-17+细胞比例为（4.6%±2.5%），胃癌组织中的细胞比例显著高于癌旁正常胃组织，此结果与大多数文献结果一致。Zhang等[9]研究发现随着宫颈癌癌变的进展，癌组织中Th17细胞的比例呈逐渐增高的趋势，并且Th17细胞的比例与临床分期、血管侵犯及淋巴结转移呈正相关。而Atarashi等[10]发现在进展期卵巢癌TIL中IL-17+的表达较早期卵巢癌低，并且Th17细胞对进展期卵巢癌患者的预后有积极作用。本研究中，我们对胃癌TIL中的Th17细胞进行分析后发现，在早期胃癌TIL中CD4+IL-17+细胞比例为（12.4%±7.6%），癌旁正常胃黏膜IEL中细胞比例为（5.1%±2.9%）；在进展期胃癌TIL中CD4+IL-17+细胞比例为（8.7%±6.8%），癌旁正常胃黏膜IEL中的细胞比例为（4.3%±2.1%）。无论早期胃癌还是进展期胃癌，CD4+IL-17+细胞在癌组织的表达均高于癌旁正常胃黏膜组织，早期胃癌组织的表达又明显高于进展期胃癌组织。提示胃癌组织中，Th17细胞在局部集聚可能发生于肿瘤的早期，随着肿瘤的进展，局部微环境发生改变，导致Th17细胞的分布发生改变，浸润的Th17细胞数量逐渐降低。但有研究表明，在鼠类模型中，随着肿瘤的进展Th17细胞数量逐渐升高，随后在肿瘤的进展期达到最高水平[11]。这种研究结果的不同可能是由于鼠和人类的肿瘤生物学行为的不同，在鼠类肿瘤模型中种植的肿瘤生长迅速而人类肿瘤是逐渐进展的并且生长缓慢。

近年来，研究者对Th17细胞的表达与不同类型肿瘤患者预后之间的关系进行了研究，得出不同的结论。Tosolini等[12]对结直肠癌肿瘤微环境中Th17细胞的表达与患者预后进行了分析，结果显示：肿瘤组织中CD4+IL-17+细胞的表达与患者的预后呈负相关，CD4+IL-17+细胞对肿瘤的侵袭和转移有促进作用。相反，Kryczek等[13]在卵巢癌中的研究表明：在TIL中CD4+IL-17+细胞高表达的患者有较好的预后，并且生存时间明显延长。本研究对胃癌肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞的分析表明：在120例患者中，低表达组5年生存率为40.4%，而高表达组为58.7%；肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞高表达的患者预后较好，提示CD4+IL-17+细胞的表达与胃癌患者的预后呈正相关。

综上所述，Th17细胞在胃癌肿瘤微环境中的分布与疾病的进展、患者的预后密切相关，有可能成为预测胃癌患者生存的重要免疫指标。

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The distribution and clinicalsignificanceof Th17 cells in the tumor microenvironmentof gastric cancer

JIANGWei1WANG Fu-jing2KANG Yue2#1TheMedicalDepartment,the Hospitalof Harbin Engineering University,Harbin 150001,China
2The Tenth Departmentof GeneralSurgery,the Second A ffiliated Hospitalof Harbin MedicalUniversity,Harbin 150086,China

ObjectiveTo explore the distribution trends of Th17 cell in the tumor m icroenvironment as the gastric cancer progresses,and to investigate the correlation between Th17 cell and prognosis and survival of patients.MethodIn 60 cases of gastric cancer patients,the positive expression and distribution of Th17 cells in each tumor stage were detected by flow cytometry analysis(FACS).The expression of Th17 cells in 120 cases of gastric cancer patients were verified by immunohistochem istry(IHC).And the relationship between the expression of Th17 cells and the prognosis of gastric cancer patients were analyzed.ResultFresh tissue specimens of 60 gastric cancer patients were collected and analyzed,the positive expression of Th17 cells in tumor tissue was higher than that in the normal gastric tissue(10.3%±7.2%)vs(4.6%±2.5%),w ith statistically significant difference(P＜0.05).And the positive expression of Th17 cells in tissue w ith advanced disease was significantly decreased compared to that in those w ith early-stage disease(8.7%±6.8%)vs(12.4%±7.6%),(P＜0.05).In 120 post-gastrectomy tissue specimens,the 5-year survival rate was 58.7%in patients w ith high Th17 cell expression,and was 40.4%in those w ith low Th17 cell expression,and the difference was significant(χ2=4.634,P=0.031).ConclusionThe high expression of Th17 cell in the tumormicroenvironment was closely related w ith the progression of disease and the survival of the patients and may serve as an important and predictive immune indicator for survival.

Th17 cells;m icroenvironment;prognosis;gastric cancer

R735.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.04.11

黑龙江省自然科学基金（D201169）

#通信作者（corresponding author），e-mail：kangyue2002@126.com

2014-10-20）