赵鹏，张婷婷，宋逍，唐志书

（陕西中医学院药学院，陕西 咸阳 712046）

倒卵叶五加（Acanthopanax obouatus Hoo）属五加科（Araliaceae）五加属植物，分布于陕西、宁夏、甘肃等地，多糖是其主要的活性成分之一，具有明显的调节机体免疫、抗氧化性等生物活 性[1-3]。目前对于倒卵叶五加多糖的研究主要集中在分离纯化、药理活性等方面，而对其进行衍生化方面的研究尚未见报道。

对于多糖进行衍生化的方法主要包括物理法、化学法及生物法等。利用化学的方法对多糖的分子结构进行修饰，能够提高其生物活性，甚至赋予其新的生物活性。正因为如此，对于多糖的衍生化研究已成为多糖研究者重点关注的热点之一[4-8]。

本研究在前期对倒卵叶五加多糖分离纯化的研究基础之上，利用响应面法对倒卵叶五加多糖羧甲基化修饰的合成工艺条件进行了优化研究，并初步研究了羧甲基化后多糖的抗氧化性，考察羧甲基化修饰对倒卵叶五加多糖抗氧化活性的影响。本研究成果为把倒卵叶五加多糖及其羧甲基化衍生物开发成为新型、安全、天然的药品、功能性食品添加剂提供了一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

倒卵叶五加购自西安万寿路中药材批发市场，氯乙酸、异丙醇、乙醇、乙醚、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、邻苯三酚及其他试剂均为国产分析纯。

UV-2501PC 紫外可见分光光度仪，日本岛津公司；FA2004 电子天平，上海精科天平厂；H2050R 台式离心机，湖南湘仪公司；ALPHA1-4型真空冷冻干燥机，德国CHRIST 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 倒卵叶五加多糖的制备

将倒卵叶五加在80℃下干燥，粉碎后过60 目筛。再将其用无水乙醇在回流下脱脂两次，过滤，滤渣晾干后，用双蒸水，按料液比1∶15（g/mL）80℃下提取2次，提取液合并，再按1g生药材浓缩为1mL 进行浓缩，浓缩液经脱蛋白、脱色处理后醇沉，即得倒卵叶五加粗多糖，用水复溶后，再用Sephadex G-100 凝胶柱进行纯化，收集多糖富集峰，浓缩后冻干即得倒卵叶五加多糖，经测定该多糖含量为98.4%（质量分数），经高效凝胶色谱法检测，其为均一多糖，分子量为8.7kD。

1.2.2 倒卵叶五加多糖的羧甲基化

参照文献[4]的方法，先精确称取一定量的多糖样品，加入适量异丙醇与20%的NaOH 的混合溶液将其溶解；再将氯乙酸溶于异丙醇中，并加入适量的20%的NaOH 溶液混合均匀。在一定温度下，往多糖溶液滴加一定量氯乙酸的异丙醇溶液。滴加完毕，恒温反应一段时间后，待反应结束，冷却至室温，再用盐酸溶液将反应液调为中性。将反应液装入截留相对分子质量为3500 的透析袋中用流动水透析48h。透析液浓缩后即得羧甲基化修饰的倒卵叶五加多糖。

1.2.3 倒卵叶五加多糖羧甲基化取代度的测定

参照文献[4]，测定羧甲基化倒卵叶五加多糖的取代度。

1.2.4 抗氧化性能测试

参照文献[9]测试样品对超氧阴离子和羟自由基的清除效果。

2 结果与讨论

2.1 倒卵叶五加多糖羧甲基化的合成工艺

2.1.1 反应时间的影响

预设反应温度50℃，氯乙酸浓度为2.0mol/L，确定最优的反应时间，结果见图1。

图1 所示的结果说明，当反应时间为1.0～4.0h时，多糖羧甲基化取代度的值快速增大，当反应时间为4.0h时，达到最大。随着反应时间的进一步延长，副反应也在增多，使得氯乙酸的利用率反而降低，并且当时间过长时，反应条件下，多糖的降解程度也在增加，从多糖的取代度及稳定性考虑，因此确定最优的反应时间为4.0h。

2.1.2 氯乙酸浓度的影响

预设反应温度50℃，反应时间为4.0h，确定最优的氯乙酸浓度，结果见图2。

图2 所示的结果说明，随着氯乙酸浓度的逐步增加，多糖羧甲基化取代度的值逐渐提高，在此阶段氯乙酸与氢氧化钠生成氯乙酸钠来进攻多糖的活性中心，而生成羧甲基化的多糖，此时生成的氯乙酸钠越多，多糖的羧甲基化取代度就越高。但随着氯乙酸浓度的增大，体系内的氢氧化钠已经完全转化为氯乙酸钠后，其对多糖羧甲基化取代度的影响就不是很大了，而且酸性过强，易于引起多糖的降解，因此确定最优的氯乙酸浓度为3.0mol/L 左右。

2.1.3 反应温度的影响

预设反应时间为 4.0 h、氯乙酸浓度为3.0mol/L，确定最优的反应温度，结果见图3。

图1 反应时间的影响

图2 氯乙酸浓度的影响

图3 反应温度的影响

图3 所示的结果说明，随着反应温度的增加，多糖羧甲基化取代度的值逐渐增大，当到70℃达到最大。随着温度的进一步提高，取代度反而降低，这是因为开始随着温度的提高，反应速率增加，但随着温度的进一步增加，副反应速率也在增加，使得氯乙酸的利用率反而降低，并且当温度过高时，反应料液颜色加深，反应条件下，温度过高还能导致多糖的降解，因此反应应在70℃左右 进行。

2.1.4 倒卵叶五加多糖羧甲基化工艺条件优化

本研究按照Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，在单因素实验的基础之上，以羧甲基取代度（DS）为响应值，选取反应时间、氯乙酸的浓度和反应温度等3 个对反应具有较大影响的单因素进行响应面实验，来优化倒卵叶五加多糖羧甲基化的工艺条件。实验因素和水平设计如表1 所示，响应面得到的实验及分析结果如表2 和表3 所示。

采用Design-Expert 7.01 软件对响应面优化试验得到的结果进行分析研究，试验结果见表2，按照各因素对取代度（y）的影响进行二次方程拟合，拟合得到式（1）。

由方差分析表3 的分析结果可以看出，回归方程的F 值为39.41，其显著水平远远低于0.05，这说明，利用响应面法拟合得到的试验模型显著型极高，按照拟合模型得到的回归方程，考察其因变量与自变量之间的线性相关系数后发现，r=0.9846，这一点表明用该数学模型来评估各相关因素对倒卵叶五加多糖羧甲基化取代度的影响相对准确。对表3 的方差分析结果可以看出，响应面试验组合的各单因素中，对倒卵叶五加多糖羧甲基化取代度的影响最大的是反应温度，其次是氯乙酸浓度，反应时间的影响最小，各因素之间的交互影响并不明显。

表1 实验因素水平表

表2 响应面分析实验方案及实验结果

表3 方差分析表

2.1.5 响应面图分析

通过响应面优化实验分析可以得到相应的响应面图，响应面图可以更加直观的反应出各单因素对倒卵叶五加多糖羧甲基化取代度的影响结果以及各单因素之间交互影响的强弱关系。响应面实验得到的等高线图见4～图6。

图4 氯乙酸浓度与反应时间对倒卵叶五加多糖羧甲基化 取代度的影响

图5 反应温度与反应时间对倒卵叶五加多糖羧甲基化 取代度的影响

图6 反应温度与氯乙酸浓度对倒卵叶五加多糖羧甲基化 取代度的影响

对比图4～图6 可知：反应温度对倒卵叶五加多糖羧甲基化的取代度的影响极为显著，图中可看出其绘制的曲线最为陡峭；氯乙酸浓度对羧甲基化的影响次之，而影响最小的则是反应时间，相较于氯乙酸浓度而言，其曲线较为平滑一些。通过响应 面法预测得到的回归模型分析[10-11]， 可预测得到倒卵叶五加多糖羧甲基化的最优合成工艺条件是：反应时间是4.11h，氯乙酸浓度是3.26mol/L，反应温度是76.42℃，预测的工艺条件下，得到的羧甲基化多糖的取代度为0.559。

2.1.6 验证实验

按照上述预测的结果，从实验操作的可操作性考虑，微调上述工艺条件为：反应时间4.1 h，氯乙酸浓度是3.3 mol/L，反应温度75℃。分别用0.1 g 的倒卵叶五加多糖，在微调后的羧甲基化修饰的工艺条件下，做3 次多糖羧甲基化平行试验，得到的羧甲基化倒卵叶五加多糖基取代度的平均值为0.557，实验结果表明，通过回归方程预测得到的工艺条件与实际操作工艺条件十分吻合。

2.2 羧甲基化倒卵叶五加多糖的抗氧化活性

2.2.1 羟自由基的清除实验

本研究以Vc 作为阳性对照品，分别考察了倒卵叶五加多糖羧甲基化修饰前后对羟自由基的清除作用，实验结果见图7。

由图7 可知，经过羧甲基化修饰后的倒卵叶五加多糖清除羟自由基的最大清除率为71.3%，比羧甲基化前多糖的最大清除率46.3%提高了25.0%，清除羟自由基的能力有了明显的提高，其最大清除率基本可达到阳性对照品Vc 的水平。

2.2.2 超氧阴离子的清除实验

本研究以Vc 作为阳性对照品，分别考察了倒卵叶五加多糖羧甲基化修饰前后对超氧阴离子的清除作用，实验结果见图8。

由图8 可知，经过羧甲基化修饰后的倒卵叶五加多糖清除超氧阴离子的最大清除率为90.3%，比羧甲基化前多糖的最大清除率26.2%提高了64.1%，清除超氧阴离子的能力也有了明显的提高，但其清除超氧阴离子的能力不及阳性对照品Vc。

图7 羟自由基的清除实验

图8 超氧阴离子的清除实验

上述抗氧化性实验结果说明，羧甲基化修饰倒卵叶五加多糖，可有效地提高其抗氧化活性，这也许是对倒卵叶五加多糖进行羧甲基化后，其溶解性以及空间构象发生了改变，从而改善了多糖的抗氧化活性，对于其具体的原因还在进一步研究之中。

3 结 论

通过对倒卵叶五加多糖进行羧甲基化修饰的工艺路线进行研究，使用响应面分析方法优化了其最优的修饰工艺条件，结果表明：反应时间4.1h，氯乙酸浓度是3.3mol/L，反应温度75℃，在此条件下修饰制得的羧甲基化倒卵叶五加多糖的羧甲基化取代度为0.557，利用该方法对多糖进行羧甲基化修饰，具有反应可操作性强、试剂价廉易得、多糖的羧甲基化取代度较高的优点，是一种较理想的多糖羧甲基化修饰方法。通过倒卵叶五加多糖羧甲基化衍生物超氧阴离子和羟自由基的清除实验表明，经过羧甲基化修饰后的抗氧化能力较之羧甲基化修饰前的倒卵叶五加多糖有了非常明显的改善，其抗氧化能力进一步增强，关于羧甲基化能显著增强多糖抗氧化性的原因还在进一步深入研究之中。