赵成亮，宋有鑫，赵龙，张四喜，李连泰

(1.承德医学院附属医院 骨六科，河北 承德 067000；2.吉林大学第一医院 药剂科，吉林 长春 130021；3.承德医学院附属医院 骨伤科，河北 承德 067000)



Zn(PMFPCl)2对肝癌HepG2细胞的抑制作用及其机制

赵成亮1，宋有鑫1，赵龙1，张四喜2，李连泰3Δ

(1.承德医学院附属医院 骨六科，河北 承德 067000；2.吉林大学第一医院 药剂科，吉林 长春 130021；3.承德医学院附属医院 骨伤科，河北 承德 067000)

目的 探究Zn(PMFPCl)2对肝癌HepG2细胞的抑制作用及其机制。方法 HepG2细胞分组为对照组及实验组(10、30、70 μmol/L)。MTT法检测Zn(PMFPCl)2对肝癌HepG2细胞增殖的影响，流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期，倒置显微镜下观察Zn(PMFPCl)2作用后肿瘤细胞的形态学变化，Western blot检测凋亡蛋白p53、p21、caspase-3、bax、bcl-2的表达情况。结果 各实验组(10、30、70 μmol/L)在24、48、72 h对细胞的抑制率均显著高于对照组(P<0.05)。当Zn(PMFPCl)2浓度70 μmol/L，作用72 h时细胞的抑制率最高，达63.29%。各实验组在48 h时的细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。Zn(PMFPCl)2使细胞的生长停滞在G1期，阻碍细胞增殖。当Zn(PMFPCl)2作用细胞后贴壁细胞数量减少，细胞皱缩，细胞膜出现突起，细胞变圆、变亮。Western blot法检测p53、p21、caspase-3、bax随配合物浓度的增加而增加，而bcl-2随之减少(P<0.05)。结论 Zn(PMFPCl)2对肝癌HepG2细胞具有抑制增殖及促进凋亡的作用，其机制与促进p53、p21、caspase-3、bax表达而降低bcl-2表达有关。

Zn(PMFPCl)2；HepG2细胞；增殖；细胞周期；凋亡相关蛋白

过渡金属配合物作为一种重要的DNA靶向化合物，其抗肿瘤、抗菌等作用逐渐被人们发觉，并希望其能代替铂成为杀伤肿瘤的一大利器。铜配合物具有极强的生物活性及多样的结构，之后的研究也证实了铜配合物能够抑制有丝分裂进而抑制细胞增殖[1-3]。但相比之下同样作为过渡金属的锌，其配合物的研究却较少。Zhong等[4]发现了一种席夫碱的锌配合物对肿瘤细胞具有一定程度的抑制作用。本实验中同样合成一种二-(1-对甲苯基-3-甲基-4-呋喃甲酰基吡唑啉酮-5缩对甲苯胺)合锌(II)[Zn(PMFPCl)2]，并对其抗肿瘤活性及机制进行了探讨。为证明锌配合物具有抗肿瘤特性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株：肝癌HepG2细胞由吉林大学微生物实验室提供。

主要试剂：胎牛血清、DMEM高糖培养基、青链霉素、PBS、RPMI-1640培养液(Hyclone)；DMSO(上海生工生物工程公司)；噻唑蓝(Amersco)；PI染色试剂盒、FITC/PI细胞凋亡试剂盒(上海贝博生物)。

主要仪器：微孔滤器(Millipore)；96孔培养板(Coring)；CO2培养箱(Forma)；680型酶标仪(Bio-Rad)；FaCS CantoTM II system流式细胞仪(Becton-Dickinson Bioscience)。倒置显微镜IX71(OLYMPUS)；RNApure高纯总RNA快速提取试剂盒(北京BioTeke生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记p53、p21、caspase-3、bcl-2、bax和β-actin鼠抗IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗(江苏碧云天生物技术有限公司)；BCA法蛋白质定量测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(江苏碧云天生物技术有限公司)；垂直电泳装置及转膜装置(Bio-rad)。

Zn(PMFPCl)2的制备：本实验中使用的Zn(PMFPCl)2由张恒强博士惠赠，其结构式见图1。

图1 Zn(PMFPCl)2结构式Fig.1 The chemical structural formula of Zn(PMFPCl)2

细胞培养：将HepG2肝癌细胞悬浮于含有10%灭活胎牛血清的无菌RPMI1640培养液中，再将细胞株装于5 cm×5 cm悬浮细胞培养瓶中。置于37 ℃、5%CO2及100%饱和湿度的CO2培养箱中培养。每48～72 h更换一次培养液。

1.2 检测指标

1.2.1 MTT法检测Zn(PMFPCl)2对HepG2肝癌细胞增殖

的影响：使用胰蛋白酶消化处于对数生长期的HepG2肝癌细胞，使其成为细胞悬液。将细胞接种于96孔板中，确保每孔细胞数为4×105个；再加入浓度为10、30、70 μmol/L的Zn(PMFPCl)2为各实验组，对照组中为0.1%DMSO，设置5个复孔；相互作用24、48、72 h后加入MTT试剂(5 mg/ml，20 μL)，37 ℃，5%CO2条件下培养4 h。加入DMSO溶解后，酶标仪上测定A570，同时设置空白孔。计算细胞抑制率(%)=1-实验孔A值/对照孔A值。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡：将上述各组细胞接种于培养瓶中，待隔夜细胞贴壁并呈指数生长时更换含药物Zn(PMFPCl)210、30、70 μmol/L的培养液，并同时设置对照组，每组设置3个复孔。作用48 h后，收集细胞，常温1000 r/min离心5 min，弃去培养液，使用预冷PBS重悬细胞后再次按上述条件离心，重复2次。将收集细胞用预冷的75%乙醇固定。再次离心后弃去固定液，用PBS洗涤2次。加入200 μL PI，置于4 ℃环境25 min。使用400目筛网过滤1次后使用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期。

1.2.3 细胞形态学观察：将上述各组细胞置于37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱中培养48 h，利用倒置显微镜(×200)观察细胞形态并拍照。

1.2.4 Zn(PMFPCl)2对凋亡蛋白的影响：细胞分组及培养如1.2.1，每组设置3个复孔，一抗目的蛋白按1:1000，内参按 1:2000 比例稀释，4 ℃孵育过夜，二抗按1:1000，内参按1:2000比例稀释，室温摇床孵育膜1 h。参照张小年[5]的方法利用Western blot检测Zn(PMFPCl)2对HepG2肝癌细胞中p53、p21、caspase-3、bcl-2、bax 5种凋亡相关蛋白表达情况的影响。

2 结果

2.1 Zn(PMFPCl)2对HepG2肝癌细胞增殖的影响 细胞抑制率随Zn(PMFPCl)2浓度增加而逐渐增加，同时相同浓度 Zn(PMFPCl)2， 随作用时间的延长，对细胞的抑制率也逐渐增强。各实验组对细胞的抑制率均显著高于对照组(P<0.05)。当 Zn(PMFPCl)2浓度70 μmol/L，作用72 h时细胞的抑制率最高，达63.29%。见表1。

表1 MTT法观察Zn(PMFPCl)2对肝癌HepG2细胞增殖的影响

*P<0.05，与对照组比较，compared with control group

2.2 流式细胞仪检测Zn(PMFPCl)2对细胞凋亡和细胞周期的影响

2.2.1 Zn(PMFPCl)2对细胞凋亡的影响：流式细胞仪检测Zn(PMFPCl)2作用肝癌HepG2细胞48h后的凋亡情况。对照组与各实验组(10、30、70 μmol/L)的凋亡率分别为(12.63±1.18)%、(17.65±1.44)%、(29.36±1.33)%、(70.13±1.29)%，各实验组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 流式细胞仪检测Zn(PMFPCl)2对细胞凋亡的影响(n=3)*P<0.05，与对照组比较Fig.2 Effect of Zn(PMFPCl)2 on cell apoptosis by flow cytometry instrument(n=3)*P<0.05，compared with control group

2.2.2 Zn(PMFPCl)2对细胞周期的影响：流式细胞仪检测结果显示，当Zn(PMFPCl)2浓度逐渐增加时，各组处于G1期的细胞所占百分比逐渐增加，S期细胞百分比明显减少，而G2期细胞百分比变化却不明显。故Zn(PMFPCl)2使肝癌HepG2细胞的生长停滞在G1期，使细胞周期由G1期向S期的移行受到阻滞，细胞生长速率也因此降低。见图3、表2。

图3 流式细胞仪检测Zn(PMFPCl)2对细胞周期的影响Fig.3 Effect of Zn(PMFPCl)2 on cell cycle by flow cytometry 表2 Zn(PMFPCl)2对细胞周期的影响结果Tab.

组别细胞周期G1SG2对照组1.27±0.2694.50±1.654.23±0.9210μmol/L20.35±1.1158.85±1.5520.80±1.3630μmol/L43.71±3.1742.18±2.7614.11±1.6770μmol/L72.69±2.1512.47±1.5914.84±1.42

2.3 细胞形态学观察结果 不同浓度Zn(PMFPCl)2作用肝癌HepG2细胞48 h后细胞生长的形态变化，见图4。对照组细胞贴壁良好，细胞边缘清晰，能够融合聚集。当Zn(PMFPCl)2作用细胞后贴壁细胞数量减少，细胞皱缩，细胞膜出现突起，细胞变圆、变亮。上述现象随Zn(PMFPCl)2浓度的增加而逐渐变得明显。

图4 倒置显微镜观察Zn(PMFPCl)2对肝癌HepG2细胞形态的影响(×200)Fig.4 Effect of Zn(PMFPCl)2 on morphology of HepG2 cellsobserved by inverted microscope(×200)

2.4 Zn(PMFPCl)2对凋亡蛋白的影响 不同浓度 Zn(PMFPCl)2作用于肝癌HepG2细胞后凋亡相关蛋白的表达情况。在p53的表达中，30 μmol/L(9.53±0.47)和70 μmol/L组(21.72±1.53)与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。在p21的表达中仅有70 μmol/L组(15.28±0.91)与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。在Caspase-3中10 μmol/L组(6.31±0.71)、30 μmol/L组(13.27±2.39)、70 μmol/L组(17.66±1.46)与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。在bax中10 μmol/L(6.08±0.35)、30 μmol/L(10.00±0.61)、70 μmol/L组(17.5±1.79)与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。且上述各组随浓度增加蛋白表达增加。在bcl-2中30 μmol/L(2.01±0.10)和70 μmol/L组(1.39±0.22)与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，表达量随浓度增加而减少。见图5。

图5 Western blot检测Zn(PMFPCl)2对凋亡蛋白p53、p21、caspase-3、bax、bcl-2表达的影响(n=3)*P<0.05，与对照组比较Fig.5 Effects of Zn(PMFPCl)2 on expression of apoptosis proteins of p53, p21, caspase-3, bax and bcl-2 in HepG2 cells by Western blot(n=3)*P<0.05，compared with control group

3 讨论

过渡金属配合物能够抑制肿瘤细胞已经成为其倍受关注的特性。近期以来发现大量铜、钌等过渡金属配合物具有抗肿瘤的作用[6-7]。但是关于锌配合物抗肿瘤作用的报道极少。本实验中合成一种配合物Zn(PMFPCl)2，经MTT及流式细胞仪检测发现其具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。并且存在剂量依赖性，当浓度为70 μmol/L时其抑制率最高达63.29%。流式细胞仪检测细胞周期实验发现其能阻滞肿瘤细胞停留于G1期。

关于细胞凋亡往往由多种凋亡蛋白及基因决定。P53能够调节细胞周期，使细胞生长停滞在G1期，同时修复受损DNA，若DNA无法修复则启动细胞凋亡[8]。P21位于p53下游与p53共同构成细胞周期检查站，通过降低增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)活化DNA聚合酶能力抑制DNA的合成，进而减少受损DNA的复制及积累[9]。Bax是促进凋亡的蛋白与bcl-2形成异二聚体后降低bcl-2对细胞的凋亡，而bcl-2与其作用相反，通过抑制bax进一步抑制细胞色素C对caspase串联通路的活化途径保护细胞[10-11]。本实验中发现Zn(PMFPCl)2能使p53、p21、caspase-3、bax促进细胞凋亡的蛋白表达增加，而bcl-2抑制细胞凋亡的蛋白减少。从而在机制上揭示了Zn(PMFPCl)2具有抗肿瘤的作用。

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(编校：王俨俨)

Inhibition of Zn(PMFPCl)2on HepG2 cells and its mechanism

ZHAO Cheng-liang1, SONG You-xin1, ZHAO Long1, ZHANG Si-xi2, LI Lian-tai3Δ

(1.The Sixth Department of Orthopedics, The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China; 2.Department of Pharmacy, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China; 3.Department of Bone Traumatology, The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

ObjectiveTo explore the inhibition of Zn(PMFPCl)2on HepG2 cells and its mechanism.MethodsThe HepG2 cells were divided into control group and experimental group of 10, 30 and 70 μmol/L.The cell proliferation was detected by MTT assay, cell apoptosis and cell cycle was analysed by flow cytometry, cellular morphological change was observed with inverted microscope and the expressions of apoptosis-regulated proteins of p53, p21, caspase-3, bax and bcl-2 in HepG2 cells were detected by Western blot.ResultsThe inhibitory rates of experimental groups (10, 30, 70 μmol/L) at 24, 48 and 72h were significantly higher than those of control group (P<0.05), and the highest one was 63.29% of 70 μmol/L Zn(PMFPCl)2at 72 h.The apoptosis rates of each experimental group at 48h was significantly higher than that of control group (P<0.05).The cells were induced a remarkable G1 arrest by Zn(PMFPCl)2which could inhibit proliferation.The number of adherent cells reduced and cells shrank, convex on cytomembrane surface appeared and the cells changed to round and were brighter.Western blot results showed that the protein levels of p53, p21, caspase-3 and bax increased and bcl-2 decreased with the Zn(PMFPCl)2concentration increasing (P<0.05).ConclusionZn(PMFPCl)2could inhibit the proliferation and promote apoptosis of HepG2 cells whose mechanisms are promotation of p53, p21, caspase-3 and bax expressions and inhibition of bcl-2 expression.

Zn(PMFPCl)2; HepG2 cells; proliferation; cell cycle; apoptosis-regulated proteins

河北省卫生厅科研基金项目(ZL20140116)；吴阶平医学基金会临床科研专项基金(320.6750.14119)

赵成亮，男，主治医师，研究方向：肿瘤及药物化学，E-mail：38221965@qq.com；李连泰，通信作者，男，硕士，副主任医师，研究方向：脊柱肿瘤，E-mail：liliantai369@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)10-0011-04