左 璐，方 芳，杨 军，隋小芳，张志国，雷力力

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

佳木斯地区健康人群与高血压患者CYP3A4*1G基因多态性分析①

左 璐，方 芳，杨 军，隋小芳，张志国，雷力力

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：通过比较本地区健康人与高血压患者CYP3A4*1G基因多态性的差异，探讨CYP3A4*1G基因多态性与高血压病的易感关系。方法 ：采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测本地区健康人与高血压患者的CYP3A4*1G基因型分布及等位基因频率，通过χ2检验来比较本地区健康人与高血压患者基因型分布差异和等位基因频率差异。结果：高血压患者与健康人的基因分布及等位基因频率差异有显著性和高度显著性(P<0.05和P<0.01)。结论：高血压病的发生与CYP3A4*1G的碱基变异具有相关性。

高血压；CYP3A4*1G；基因多态性；PCR-RFLP

高血压是一种由环境因素和遗传因素共同决定的多基因疾病。它与遗传因素、民族和地区差异的相关性研究报道很多[1～3]，尤其是与药物相关基因多态性的关联及其药物相关基因多态性分型用于指导临床的可能性探讨[4～6]现已受到重视。 药物代谢相关基因细胞色素CYP450中的CYP3A含量占有较大的比例且以多种形式存在，占CYP450家族的30%，人体内约有50%的药物都是经由CYP3A的代谢。CYP3A4位于细胞色素CYP450的CYP3A亚族中，主要位于人的肝脏和小肠中。国内外学者陆续报道CYP3A4基因存在多态性，CYP3A4*1G (20230G>A)是2004年发现的CYP3A4等位基因，在中国汉族人群中的发生频率约为22.1%～37%[7]。本研究采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测本地区健康人与高血压患者的CYP3A4*1G基因型分布及等位基因频率，分析CYP3A4*1G基因多态性与高血压病的关系。

1 仪器与试药

1.1 仪器

聚合酶链反应PCR仪(S1000 Thermal Cycler)：美国BIO-RAD公司；凝胶成像分析仪(Tacan360)：上海领成生物科技有限公司；电泳仪(Powerpac Uniwer Supply)：美国BIO-RAD公司；电泳槽(JY-SPFL)：北京君意东方电泳设备有限公司；HC-2518R高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2 试剂

DNA提取纯化试剂盒，GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit(美国Fermentas公司)；Taq DNA聚合酶Hot Start Green PCR Master Min 2×(美国Fermentas公司)、引物合成(上海生工生物工程有限公司)；限制性内切酶 SmaⅠ、Rsa Ⅰ、HphⅠ(Fermentas公司)；Gene Ruler(Fermentas公司)、琼脂糖Regular agarose G-10(西班牙)、GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain(美国)、Tris(Sgma公司)、EDTA(Sigma公司)。

2 方法

2.1 标本来源

随机选取健康体检人员中心电图、胸透、血尿常规、肝肾功能均正常人员体检剩余血球(含部分血浆)；高血压患者标本来源于佳木斯大学附属第一医院高血压患者血清药物浓度测定后剩余血液。

2.2 CYP3A4*1G基因型检测方法

2.2.1 血液基因DNA提取：按DNA提取试剂盒说明书提取。

2.2.2 扩增(PCR)下游引物：5′- CACCCTGATGTCCAGCAGAAACT - 3′；上游引物：5′- AATAGAAAGCAGATGAACCAGAGCC - 3′。

CYP3A4*1G扩增体系：提取DNA2μL,引物各1μL，Hotstar酶10μL，水10μL。

2.2.3 PCR条件： 95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，72℃末延伸5min，35个循环。

2.2.4 CYP3A4*1G酶切及电泳：内切酶：FastDigest RsaI，其酶切位点为;5'...G T↓A C...3'3'...C A↑T G...5' 。37℃酶切5min，然后取出立即置水浴65℃灭活20min。用2%琼脂糖凝胶，电压145V，电泳60min。

2.2.5 酶切结果分析 野生型纯合子 C/C为：217、70bp；杂合子C/T为：217、70、287bp；突变型纯合子T/T为：287bp。扩增产物酶切电泳图见图1。经毛细管电泳测序，与本试验结果一致。见图2。

3 结果

本地健康人66 例和高血压患者69例基因型及基因频率见表1。

图1 CYP3A4*1G酶切

注：l为Marker， 5、6为CC型野生纯合子，由下至上为215bp、72 bp两个片段，4、8为TT型突变纯合子287bp片段，2、3、7、9为CT型突变杂合子由下至上为287bp、215 bp和72 bp片

图2 CYP3A4*1G基因测序经图谱 H. 野生纯合子CC型 I. 突变杂合子CT型 J. 突变纯合子TT型 表1 本地健康人和高血压患者CYP3A4*1G基因型及等位基因分布频率

CC,频率(%)CT,频率(%)TT频率(%)C,频率(%)T,频率(%)高血压患者42(60.87)25(36.23)2(2.90)109(78.99)29(21.01)健康人20(30.30)44(66.67)2(3.03)84(63.64)48(36.36)报道[8]163(50.30)142(43.83)19(5.86)468(72.22)180(27.78)

数据使用SPSS 17.0统计学软件进行处理，本地健康人与高血压患者CT等位基因概率χ2检验，χ2=7.8，P<0.01，CCCTTT三种基因型经χ2检验，χ2=12.98，P<0.01，高血压患者与本地健康人基因型分布及等位基因频率有明显的统计学差异。

高血压患者与河南健康人CT等位基因概率χ2检验，χ2=2.67，P>0.05，CCCTTT三种基因型经χ2检验，χ2=2.92，P>0.05，高血压患者与河南健康人基因型分布及等位基因频率没有统计学差异。

本地健康人与河南健康人CT等位基因概率χ2检验，χ2=3.91，0.01

从统计结果看出：健康人与高血压患者等位基因频率有高度显著性，说明高血压病的发生与CYP3A4*1G的碱基变异具有相关性。

4 讨论

CYP3A4*1G基因多态性对疾病的易感关系尚未见报道。但国内外学者对CYP3A4*1G基因多态性与一些药物代谢的关系进行了研究，认为CYP3A4*1G基因突变可以影响氨氯地平的降压疗效[8]，还可以影响枸橼酸芬太尼的代谢[9]，与抗癫痫药卡马西平、丙戊酸钠、拉莫三嗪及苯巴比妥耐药性无关[10]，本实验采用应用的是聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP) 法进行基因检测。与传统的技术相比，此法更加灵敏、准确并且操作更简便，可以同时对大量样本进行检测。对检测CYP3A4*1G基因的部分样本采用毛细管电泳法进行测序，毛细管电泳法与聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)法检测结果完全一直。证明了聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)法用于CYP3A基因检测是可行的。

高血压是多基因的遗传病，近几年来，国内学者对高血压基因多态性现象进行了大量的研究。本研究通过对69例高血压患者与66例健康人CYP3A4*1G基因检测结果分析，CYP3A4*1G在本地区健康人与患者中基因型分布及等位基因频率有显著性差异，CYP3A4*1G在本地区健康人与河南健康人等位基因频率差异有显著性；基因型分布有有高度显著性。CYP3A4*1G在高血压患者与河南健康人基因型分布及等位基因频率没有统计学差异。

说明高血压病的发生于CYP3A4*1G基因变异具有相关性。但由于本研究高血压病例较少，由于缺少突变纯合子组，就此说明CYP3A4*1G基因是高血压的易感基因尚早，还有待于扩大病例进一步研究。

[1]刘圣航，杨军，张志国，等.原发性高血压患者CYP2D6*10不同基因型的心率震荡及美托洛尔的干预作用[J].心血管康复医学杂志,2014,23(1):23-26

[2]董天崴，杨 军，王爽，等.CYP3A4*1G基因多态性对比索洛尔代谢及高血压患者左室重构的影响[J].中国老年学杂志,2014,34(10):2625-2626

[3]杨军，王爽，董天崴，等.CYP2D6*10基因多态性与美托洛尔治疗高血压疗效的关系[J].心血管康复医学杂志，2014,23(2):155-159

[4]董天崴，王爽，王立波，等.比索洛尔按基因导向治疗高血压的疗效[J].心血管康复医学杂志,2014,23(5):523-526

[5]张峰，杨军，魏晓冬，等.CYP2D6*10基因多态性与美托洛尔基因导向治疗对高血压患者左室重构影响的研究[J].黑龙江医药科学，2014,37(1)：108-109

[6]魏晓冬，张峰,李娟，等.CYP3A4*1G与比索洛尔药物代谢及基因导向治疗高血压病的相关性研究[J]. 黑龙江医药科学,2014,37(1):46-47

[7]任欣伟，杨卫红，李彦鹏.河南汉族人群CYP3A4*1G和CYP3AP*13多态性及不平衡分析[J].中国新药与临床杂志，2010,29(8)：602-605

[8]文娟，黄志军，袁洪，等. 肾移植后高血压人群中CYP3A4*1G，CYP3A5*3和MDR1C 3435T基因多态性对氨氯地平降压疗效的影响[J].中国动脉硬化杂志，2011,19(1)：55-60

[9]张豪勇. CYP3A4*1G多态性对女性健康志愿者静脉注射芬太尼药动学及痛阈的影响[D].郑州大学硕士研究生论文，2011年4月，IV

[10]李艳梅，王刚，黄志，等. CYP3A4基因多态性与汉族小儿耐药性癫痈的关系[J].中国新药与临床杂志,2011,30(1)：740-745

The polymorphisms analysis of healthy people and hypertension patients with CYP3A4*1G gene in Jiamusi

ZUOLu,FANGFang,YANGJun,SUIXiao-fang,ZHANGZhi-guo,LEILi-li

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Objective: To explore the relationship between CYP3A4*1G gene polymorphisms and the Hypertension pathogenesis, by comparing the differences of CYP3A4*1G Gene polymorphisms in patients with hypertension and healthy populations in Jiamusi. Method: Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was applied to detect the genotype distribution and the allele frequencies of CYP3A4*1G in patients with hypertension and healthy people; and to compare the differences between them according to Chi-square criterion. Results:There existed significant differences in the gene distribution and allele frequencies of CYP3A4*1G in patients with hypertension and healthy people (P<0.05,P<0.01).Conclusion:The hypertension pathogenesis is related with the base variations of CYP3A4*1G.

CYP3A4*1G; hypertension; gene polymorphism; PCR-RFLP

1.黑龙江省自然科学基金项目，编号：2011-86； 2.紫禁城国际药师论坛专题科研课题，编号：ZJC-2012-30。

左璐(1986～)女，黑龙江双鸭山人，在读硕士研究生。

雷力力(1958～)女，黑龙江佳木斯人，学士，主任药师，硕士研究生导师。E-mail:leill888@126.com。

R544.1

B

1008-0104(2015)01-0007-03

2014-10-17)