吴 江,张国梁,刘 杰,巩忠萍，郑极慧,吕玉光

(1.佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002 ；2.青岛大学附属医院，山东 青岛 266000；3.佳木斯大学化学与药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

Sm/Ag/TiO2无机纳米复合材料表征与抗菌性能研究①

吴 江1,张国梁1,刘 杰2,巩忠萍3，郑极慧3,吕玉光3

(1.佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002 ；2.青岛大学附属医院，山东 青岛 266000；3.佳木斯大学化学与药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：初步研究无机纳米材料Sm/Ag/TiO2的表征和抗菌活性。方法：通过XRD分析、TEM观察测量检测Sm/Ag/TiO2的粒子分布情况；通过抑菌环实验和液体稀释实验，测定在摩尔比为2:2:100的Sm/Ag/TiO2作用于金黄色葡萄球菌和白色念珠球菌的抗菌活性。结果：(1)XRD分析结果：Sm/Ag/TiO2的平均粒径为14.62nm；Ag离子和Sm离子以一个高度分散和非晶形式分散在二氧化钛表面；(2)TEM图像表明，谢勒公式计算出粒子的大小是12nm；(3)抗菌活性结果：当摩尔比是2:2:100时，抑菌圈直径为16mm；最小抑菌浓度为200μg/mL；最小杀菌浓度为2×104μg/mL。结论：无机纳米材料Sm/Ag/TiO2具有高比表面积、分散性和抗菌性良好的特点。

无机纳米材料；钐/银/二氧化钛；表征分析；抗菌活性

通常情况下，口腔微生态系统的平衡和失调与口腔的健康和疾病密切相关。在临床治疗各种口腔疾病时需要在口腔材料中添加一些适应口腔环境、长效、耐热、无毒、不变色的抗菌剂，其目的是维护口腔微生态系统的动力平衡，保证临床治疗远期疗效[1]。目前，兼有纳米特性和无机抗菌剂性能的纳米无机抗菌剂广泛应用于各领域[2]，其中以银系和钛系抗菌剂为代表。虽然银类抗菌剂有抗菌广谱、杀菌率高、不易产生抗药性等特点，但其成本高、易变色、纳米银粒子生物安全性等问题一直是广大研究者热论的问题[3，4]。

钛系抗菌剂受到光照条件限制、“电子—空穴对”易复合等问题的困扰，无法在口腔环境里发挥理想抗菌效果。然而，稀土元素具有4f 电子、易产生多电子组态的独特的电子层和核结构，延长光生电子-空穴对的寿命，成本低，也不存在变色问题，毒性小于Ag+，具有优异的抗菌功能和理化性能以及抗凝血、抗炎、抑癌防癌、抗肿瘤等生物学作用[5～8]。本研究主要目的是根据银和稀土的特性，借助纳米二氧化钛TiO2为载体，利用超临界流体干燥(SCFD)结合溶胶-凝胶(Sol-gel)组合技术实现无机纳米抗菌剂Sm/Ag/TiO2的合成及抗菌活性的研究。

1 实验方法

1.1 实验用品

日本理学HR-6000型X射线衍射仪(Cu靶X射线管，管压40kv，管流30mA，扫描范围10～80°),日本岛津公司生产的UV-2501PC紫外-可见分光光度计,DHG-9030型电热恒温鼓风干燥箱，JA1203型电子天平，H-J4型磁力搅拌器，SX2-2.5-12型马弗炉，800型离心机，SFT-110XW超临界萃取仪，超净工作台(上海净化设备厂)，恒温培养箱(天津市实验仪器厂)，血球计数板，XW-80漩涡混合器，电子天平秤，-40℃冷藏箱。无水乙醇(AR)，钛酸正四丁酯[Ti(OC4H9)4](AR)，盐酸(AR)，硝酸钐[Sm(NO3)3·6H2O](AR),冰醋酸(AR)，BHI培养基、沙堡培养基(无锡市赛维商贸有限公司)。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC29213)，白色念珠菌(Saccharomyces albicans，ATCC90028)(广东微生物保藏中心)。

1.2 Sm/Ag/TiO2粉体的制备

在常温条件下，选用10mL钛酸四丁酯作为前驱体、无水乙醇为溶剂，以冰醋酸作为抑制剂，浓硝酸作为催化剂，调节溶胶pH值为2～4，可以制得均匀稳定透明的二氧化钛溶胶，其中Ti(OC4H9)4、C2H5OH与H2O的摩尔比为1:12:9，控制B液滴加速度为1～25滴，磁力搅拌速度为中速，制备纳米二氧化钛粉体。将掺杂银、稀土Sm的TiO2粉末放入马弗炉中，在不同的温度下进行热处理，经超临界萃取得到无机纳米复合材料Sm/Ag/TiO2粉体。

1.3 XRD分析

利用超临界流体干燥(SCFD)结合溶胶-凝胶(Sol-gel)组合技术合成Ag/TiO2和Sm/Ag/TiO2粉体，进行XRD分析如图1、2所示。

1.4 TEM电镜下观察

利用投射电子显微镜(TEM)观察Sm/Ag/TiO2粉体的团聚情况。

1.5 菌悬液配制

用BHI培养液、沙堡培养液分别复苏金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。采用连续转接2次后的新鲜菌液培养物，分别挑取单菌落混悬于BHI培养液和沙堡培养液中，37℃下需氧培养24h，用血球计数板分别配置浓度为1×105CFU/mL的菌液，备用。

1.6 抑菌环试验

以无菌棉签蘸金黄色葡萄球菌液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂沫3次。盖好平皿，置室温干燥3min。在培养基表面打直径为5mm的小孔，两个小孔间距不少于24mm，小孔距平板边缘不少于15mm，在小孔内分别注入不同比例的抗菌剂0.2mL后，置37℃温箱孵育24h后，读取结果，抑菌圈边缘以肉眼见不到菌落明显生长为限。抑菌圈宽度(W)公式：W=(D-T)/2(D为抑菌圈的直径，T为小孔的直径)。

1.7 液体稀释法

将抗菌剂在120℃下烘烤2h后，与生理盐水配制成不同浓度的混悬液，备用。将已配置好浓度的白色念珠菌菌液分别于抗菌剂混悬液混合，不添加抗菌剂的溶液作为阳性对照；不添加菌液的溶液作为阴性对照。37℃下，需氧培养24h。之后，再从各试管内取0.02mL液体置于营养琼脂培养基上，37℃需氧培养24h后，观察结果。MIC结果：同阳性对照组相比，平板培养基上试验菌菌落个数无增加的那组抗菌剂溶液浓度值，就是抑制该菌生长的最小抑菌浓度值(MIC)。MBC结果：同阳性对照组相比，平板培养基上无试验菌菌落生长的最低抗菌剂溶液浓度值，就是抗菌剂杀灭该菌的最小杀菌浓度值(MBC)。以上实验重复3次，取平均值。

图1 在500℃、100min的条件下，TiO2、Ag/TiO2和Sm/Ag/TiO2的X射线衍射分析

2 结果

2.1 XRD 分析

图1可知，TiO2粉体的晶相是锐钛矿，在2θ=25.2，34.58，37.81，52.36处有TiO2锐钛矿的特征峰。根据谢乐公式(Scherrer)可求得Ag/TiO2的平均粒子粒径，D=14.01nm，Sm/Ag/TiO2的平均粒子粒径，D=14.62nm。Sm/Ag/TiO2的谱图中观察不到Sm的特征峰，说明Sm高度分散于粉体中，并且材料为纳米级材料。

由图2所示，Sm/Ag/TiO2的摩尔比例为2:2:100时，Ag和Sm离子以高分散或非晶态形式分散在TiO2的表面，强度更强，其晶型结构更为规整，结晶度更高，峰型更清晰。

图2 在500℃、100min条件下,不同比例的Sm/Ag/TiO2粉末的XRD分析(Sm/Ag/TiO2的添加量为：a.2:2:100;b.1:2:100;c.2:1:100;d.1:0:100)

2.2 TEM测量分析

图3显示，利用谢勒公式计算得出Sm/Ag/TiO2粒子大小是12纳米,说明在煅烧过程中Sm、Ag和TiO2的掺杂，减少了颗粒之间的聚集从而使得纳米粒子具有高比表面积、体积小和良好分散性的特点。

图3 Sm/Ag/TiO2的TEM观察

2.3 抑菌活性分析

在掺银含量一定的前提下，随着钐离子掺杂量的增加，该抗菌剂作用于金黄色葡萄球菌，抑菌圈平均直径显著增大，但是Sm/Ag/TiO2的比例超过2:2:100时，继续增加钐量，抑菌性能反而下滑，见表1(可见光条件下)。Sm/Ag/TiO2(2:2:100)对白色念珠菌的最小抑菌浓度是200μg/mL，最小杀菌浓度是20mg/mL，说明此材料的抗菌性能好。

表1 材料的抗菌活性比较

3 讨论

根据《消毒技术规范2006》以及《中华人民共和国化工行业标准：无机抗菌剂性能及评价》中的规定，说明无机纳米材料Sm/Ag/TiO2的抗菌效果较强。Brown[9]的研究发现纳米材料的细胞毒性与粒子的直径相关，颗粒较大时，粒子的细胞毒性明显降低[10]。Ahamed等[11]认为纳米银粒子诱导毒性的机制是粒子对细胞膜、线粒体和遗传物质的影响，但纳米银粒子经涂层或者表面处理后的毒性明显减小，这是由于减少了粒子与细胞成分直接接触的机会。Ag+、稀土离子半径相对于TiO2非常微小，小团簇的化学形态较均匀地分散在纳米TiO2颗粒的表面，形成包覆层。因此这种具有特殊核壳结构的纳米颗粒，大大增强了生物安全性、比表面积、抗菌性。

当细菌吸附于二氧化钛表面时，活性氧O2-和自由基·OH能穿透细菌的细胞壁，阻断其呼吸系统以及电子传输系统，从而有效地杀灭细菌；微量银离子可以与菌体中酶蛋白的巯基强烈结合，使蛋白质凝固，破坏细胞合成酶的活性,使细胞丧失分裂增殖能力而死亡；稀土Sm3+不仅可以激活光催化抗菌,还可以溶出抗菌。Ag+及Sm3+的掺入对二氧化钛进行了表面改性，由于Sm3+电对所具有的势能级高于TiO2，有效地使光生电子与空穴的分离，降低了其复合率，从而提高了TiO2光催化活性和抗菌作用。

4 结论

通过研究利用超临界流体干燥(SCFD)结合溶胶-凝胶(Sol-gel)组合技术合成的无机纳米抗菌剂Sm/Ag/TiO2的表征分析、TEM观察以及抗菌性检测，证明在摩尔比例为2:2:100时，，粒子的分散性较好、比表面积提高，并且在可见光下与口腔常见菌作用时，此种材料表现出良好的抗菌性。

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The characteristics and antibacterial activity of a rare-earth samarium/silver/titanium dioxide inorganic nanomaterials

WUJiang1,ZHANGGuo-liang1,LIUJie2,GONGZhong-ping3,ZHENGJi-hui3,LÜYu-guang3

(1.School of Stomatology, Jiamusi University,Jiamusi 154002, China;2.The Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University,Qingdao 266000, China;3.College of Pharmacy, Jiamusi University,Jiamusi 154007, China)

Objective: To study the characteristics and antibacterial activities of an inorganic nanomaterials Sm/Ag/TiO2. Methods: The Sm/Ag/TiO2particle distribution was detected by XRD analysis and TEM observation measurement. By liquid dilution and bacteriostatic ring, the test is to evaluate the antibacterial activity effects of Sm/Ag/TiO2with the molar ratio of 2:2:100 on staphylococcus aureus and white beads coccus. Results:①The average particle diameter of Sm/Ag/TiO2was 14.62 nm；Ag and Sm ions were dispersed on the surface of TiO2in a highly dispersed and amorphous form. Thus, the intensity was stronger.②The image shows that the size of the particle was 12 nm using the scherer formula.③When the optimal mole ratio is 2:2:100, the bacteriostatic circle diameter was 16 mm, the minimum bacteriostatic concentration 200μg/mL, the minimum bactericidal concentration 2×104μg/mL.Conclusion: The inorganic nanomaterials Sm/Ag/TiO2had high specific surface area with good dispersibility and antimicrobial properties.

inorganic nanomaterials; samarium/silver/titanium dioxide; characterization analysis; antibacterial

黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目，编号：12541821。

吴江(1980～)女，黑龙江鸡西人，医学硕士，主治医师。

吕玉光(1965～)男，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士研究生导师。E-mail： yuguanglv@163.com。

O611.5

A

1008-0104(2015)01-0001-03

2014-09-28)