刘立新，高月林，张羽男，张楠楠

(1.黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室，佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.黑龙江农业职业技术学院，黑龙江 佳木斯 154007)

黄酮类化合物对耐药金黄葡萄球菌mecA基因的影响①

刘立新1，高月林2，张羽男1，张楠楠1

(1.黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室，佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.黑龙江农业职业技术学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的:研究黄酮类化合物对人工诱导的耐药金黄葡萄球菌的耐药基因mecA的mRNA表达水平的影响。方法:采用纸片法测定黄酮类化合物对耐药金黄葡萄球菌的逆转作用；利用RT-PCR法测定耐药基因mecA的相对表达量。结果:耐药金黄葡萄球菌分别被芦丁、姜黄素、木犀草素、槲皮素和芹菜素作用后，耐药基因mecA的相对表达量分别为0.55，0.79，0.76，0.92，和0.84。结论:黄酮类化合物能降低金黄葡萄球菌的耐药基因mecA的表达，能对抗金黄葡萄球菌的耐药性。

黄酮类化合物；金黄葡萄球菌；耐药基因

近年来，由于抗生素的广泛应用及不合理使用，导致临床上常见的一些病原菌产生严重的耐药性，且其耐药水平不断提高，并出现了多重耐药菌株，这给人类和动物的健康带来极大的危胁，耐药菌感染已成为目前医学领域面临的一大挑战。因此，研制和发现逆转细菌耐药性的药物成为医药学研究领域刻不容缓的问题之一。 许多研究发现[1]，一些中药能不同程度地逆转细菌的耐药性，提高细菌对抗生素的敏感性。目前，对于中药耐药抑制剂的研究主要集中于复方制剂或单方中药上，而对于中药有效成分逆转细菌耐药性机制方面研究的较少。在本实验中，主要应用体外抑菌试验筛选对耐药金黄色葡萄球菌有抑菌作用的黄酮类化合物，通过测定其耐药基因相对表达量的多少，从而探讨黄酮类化合物逆转金黄葡萄球菌耐药性的分子机制，为研究开发作用效果好，毒副作用小的新型细菌耐药抑制剂提供科学的理论依据。

1 材料、试剂和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

质控菌株：金黄葡萄球菌ATCC2592，由佳木斯大学生命学院馈赠。

1.1.2 药物

芦丁、姜黄素、槲皮素、木犀草素、芹菜素购自佳木斯市广源化玻批发部。克拉维酸(北京华业寰宇化工有限公司)。

1.1.3 试剂

琼脂糖粉、水解酪蛋白、牛肉浸膏、胰蛋白胨和MH培养基均购自北京奥博星生物技术责任有限公司。TRIzol(Invitrogen公司)，Prime ScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa公司)。

1.1.4 仪器

SW-CJ-2DD单人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司)，PYX-DH450电热恒温培养箱(上海玺恒实业有限公司)，HZQ-A恒温培养摇床(HZQ-A恒温培养摇床)，Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System(Applied Biosystems，USA)。

1.2 方法

1.2.1 耐药菌株的诱导及鉴定

1.2.1.1 细菌的培养及最小抑菌浓度(MIC值)的测定

将细菌接种于平板培养基上，待长出菌落后，挑出单个菌落接种于2mL M-H培养液，37℃恒温震荡培养4～6h，使其生长浊度达9×108个mL-1。放入4 ℃冰箱备用。MIC值的测定采用试管二倍稀释法[2]。

1.2.1.2 耐药菌株的诱导

耐药菌株的诱导方法参考文献[3]：将过夜生长的细菌培养液接种于含1/2MIC青霉素的M-H琼脂培养基，37℃恒温培养12～16h，挑取单个菌落接种于M-H培养液，恒温培养12～16h，然后将菌液接种于含1×MIC青霉素的M-H琼脂培养基，恒温培养12～16h，依此类推，逐渐将M-H琼脂培养液中的药物浓度提高，直至细菌的MIC值提高至≥256倍。

1.2.1.3 耐药菌株鉴定

将自行诱导的耐药菌株均接种于平板培养基上，24h后，挑取单个菌落接种于M-H培养液，37℃恒温震荡培养4～6h，使其生长浊度达9×108个mL-1。将菌液接种到M-H琼脂培养平板上，然后贴上1μg青霉素纸片，37℃恒温培养24h后观察结果。

1.2.1.4 生物学鉴定

按全国临床检验操作规程进行[4]。

1.2.2 逆转耐药性实验

1.2.2.1 最低抑菌浓度(MIC值)的测定

测定方法参考文献[2]。

1.2.2.2 药敏试验

分别将芦丁、姜黄素、槲皮素、木犀草素、芹菜素配制成低于MIC值的药液，挑取耐药金黄葡萄球菌菌株于各浓度药液中，37℃恒温培养时间12～18h后，将菌液接种于平板培养基上，继续37℃恒温培养时间12～18h后，挑取单个菌落制成菌液，用无菌棉签蘸取菌液均匀地涂布在M-H平板培养基上，待菌液稍干贴上青霉素药敏纸片，同时设立不加药物的耐药金黄葡萄球菌组，敏感菌组和，经克拉维酸处理的耐药金黄葡萄球菌组。

1.2.3 qRT-PCR法检测mecA的mRNA水平

1.2.3.1 RNA的提取

按1.2.2.2方法将受试菌液处理后，将所有实验菌株按照经典的TRIZOL法提取总RNA[5]。

1.2.3.2 RNA的反转录成cDNA

采用Fermentas公司的反转录酶进行反转录，反转录体系见表1。

表1 反转录反应体系

体系中最后加入M-MuLV，先混匀其他的反应物，37℃水浴5～10min，然后加入反转录酶，再混匀后，40℃水浴1h，75℃ 10min，最后放置冰浴3min,即为模板cDNA。

1.2.3.3 mRNA检测

应用7300 Real-Time PCR System 和SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行荧光定量RT-PCR反应。反应体系为20μL，冰上配制反应液，反应液组成见表2，所用引物序列为：上游引物mecAF：5’ GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA 3’；下游引物mecAR：5’ CCAATTCCACATTGTTTCCGTCTAA 3’。

表2 实时荧光定量PCR反应液组成

PCR反应条件为：95℃，30s；预变性，95℃，5s；60℃，31s；循环40次。

实时荧光定量RT-PCR所测得各基因的CT值同内参基因β-actin的CT值相比较， 计算该基因的相对表达量，所用计算公式为：相对表达量=2-ΔΔCT其中 ΔCT=ΔCTNΔCTβ-actin(N为目的基因)

2 结果

2.1 耐药菌株的体外诱导及鉴定结果

经不浓度的青霉素梯度处理经过88次传代，成功地获得了大于256×MIC耐药菌株。体外诱导的耐药菌株的鉴定结果见表3，表4。

表3 耐药菌的药敏实验结果

表4 不同菌株生化鉴定结果

药敏实验表明体外诱导的耐药菌株的菌株抑菌环结果都小于10mm，生物学鉴定血浆凝固酶阳性，V-P阳性，麦芽糖、甘露醇产酸，DNA酶阳性，鉴定结果为具有耐药性的金黄葡萄球菌菌株。

2.2 药敏试验结果

将各黄酮类化合物配制成低于MIC值浓度，分别为：芦丁0.2 mg·mL-1，姜黄素0.2mg·mL-1，槲皮素0.45mg·mL-1，木犀草素0.45mg·mL-1，芹菜素0.35mg·mL-1，分别和耐药金黄葡萄球菌作用24h后药敏试验结果见，图1。结果可见，芦丁、姜黄素和槲皮素组与耐药菌对照组相比抑菌环直径差异显著(*P<0.05)；并且芦丁与耐药菌对照组相比，差异极显著(**P<0.01)，说明逆转金黄葡萄球菌耐药性效果较好；与其他各黄酮类化合物组别效果不显著(P>0.05)。

图1 黄酮类化合物对耐药菌的影响 表5 药敏实验结果

组别抑菌环直(mm)组别抑菌环直径(mm)耐药金黄葡萄球菌组9.12±1.03芦 丁16.32±1.12*敏感菌组22.38±1.25**姜黄素12.9±2.10*经克拉维酸组18.29±1.09**木犀草素10.2±1.10槲皮素13.22±1.06*芹菜素9.37±1.53

注：*P<0.05，**P<0.01与耐药菌对照组相比。

2.3 mecA的mRNA的表达

将芦丁、姜黄素、槲皮素、木犀草素和芹菜素分别配制成低于MIC值的药液，取2mL药液分别盛于5个试管中，并取挑取耐药金黄葡萄球菌接种于各试管中，37℃恒温培养时间24h后，提取总RNA，荧光定量RT-PCR分析耐药基因mRNA的表达变化。如图2所示，经黄酮类化合物培养的耐药金黄葡萄球菌耐药基因mecA的mRNA的相对表达量降低，芦丁、姜黄素、槲皮素分别将与对照组相比差异显著(P<0.05)，且芦丁与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

图2 黄酮类化合物对mecA的mRNA的表达的影响 表6 mecA的mRNA的表达

组别mRNA的相对水平组别mRNA的相对水平耐药金黄葡萄球菌组1.00±0.03姜黄素0.76±0.12经克拉维酸组0.32±0.05**木犀草素0.92±0.10槲皮素0.79±0.09芹菜素0.84±0.11芦 丁0.55±0.06**

注：*P<0.05，**P<0.01与耐药菌对照组相比。

3 结论

金黄色葡萄球菌是临床上常见的致病性较强的细菌，自从青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制，但随着青霉素的大量和广泛使用，一些金黄色葡萄球菌产生了耐药性。耐药的金黄色葡萄球菌已成医院感染的重要病原菌之一[6]。我国中药资源丰富，有着很大的潜力和广阔的应用前景。中药由于具有有效成分多，毒副作用小，残留少、作用靶位多、作用范围广以及不易产生耐药性等优点，已成为研究者们筛选耐药抑制剂的最佳选择，为解决细菌耐药性难题开辟了捷径。本课题选取不同的黄酮类化合物为受试对象进行研究。结果发现将耐药金黄葡萄球菌经过黄酮类化合物处理陪养24h后，耐药基因mecA的相对表达量降低了，并且对抗生素的敏感性提高了，尤其以芦丁的效果更明显。结果表明黄酮类化合物能对抗细菌的耐药性。

[1]秦睿岭,徐占云,李春红,等.抗耐药菌中药的研究进展[J].养禽与禽病防治,2010,3:3-4

[2]刘立新,高月林,王朝兴,等. 黄酮化合物对金黄葡萄球菌β-内酰胺酶活性的影响[J].东北农业大学学报，2013,44(3):119-122

[3]曲鹏.AcrAB外输泵介导的鸡沙门氏菌耐药性研究[D]. 2008,东北农业大学

[4]李春玲,丁永坤,王怀兵. 医院内感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的鉴定及耐药性调查[J]. 职业与健康,2003,29(5):42

[5]Gomez MI,Lee A,Reddy B，et al.Staphylococcus aureus Protein A induces airway epithelial inflammatory responses by activating T NFR1 Nat[J].Med，2004，10：842-848

[6]李宏,郭丽曼,姜振环,等.我院多重耐药菌感染监测与预防控制措施[J].黑龙江医药科学，2012,35(2)：90-91

The effects of flavonoids on mecA gene of Drug-resistant staphylococcus aureus

LIULi-xin1,GAOYue-lin2,ZHANGYu-nan1,ZHANGNan-nan1

(1.The Key Laboratory for Biological Drug of the Education Department Heilongjiang, College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2. Heilongjiang Agricultural Vocational and Technical College, Jiamusi 154007, China)

Objective: To study the effects of flavonoids on the expression levels of mecA of Drug-resistant staphylococcus aureus. Methods: The reversal effects of drug-resistant staphylococcus aureus were determined by K-B paper methods. The expression levels of mecA were determined by RT-PCR method. Results: Rutin, curcumin,luteolin, quercetin and celery were acted on staphylococcus aureus, respectively which showed that the expression levels of mecA were 0.55，0.79，0.76 ，0.92 and 0.84. Conclusion: Flavonoids can reduce the meca gene expression of drug-resistance Staphylococcus aureus, and it can compete against drug resistance of Staphylococcus aureus.

flavonoids;staphylococcus aureus; Drug-resistant gene

黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号：12521560。

刘立新(1978～)女，黑龙江佳木斯人，在读博士研究生，讲师。

R378.1+1

A

1008-0104(2015)01-0004-03

2014-09-09)