王东胜 吕 燕 王 兴

对于采用骨粉、骨支架材料修复骨缺损，以及观察人工种植牙修复结果的研究中，不脱钙骨磨片技术是必要的检测手段。此方法自上世纪80 年代以来，得到了广泛的应用。本实验室自上世纪九十年代开始利用此项技术，经过不断的探索，已应用于各类骨缺损修复的实验研究，以及人工种植牙与骨结合的研究中[1]。

但在我们应用的过程中发现，许多实验者对于采用不脱钙骨磨片的具体应用范围还不明确，特别是制成磨片后采用哪种染色方法可以得到较理想的实验观测结果，了解就更少。文献对此类问题也无较全面阐述。针对于此，我们对在本实验室2010年-2015 年所制作的100 张磨片中，对其所应用的修复材料以及采用的染色方法进行了对比分析，就不同的实验目的、材料，应该采用哪种染色方法进行了研究，以期对于此类研究者在染色方法的选择上提供参考。

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 设备及材料 EXAKT 300 CP 骨组织切割机(EXAKT 公司，德国)；EXAKT 400 CS/AW 骨组织磨片机(EXAKT 公司，德国)；EXAKT E520 光固化包埋机(EXAKT 公司，德国)；K320磨盘纸(EXAKT 公司，德国)；P800 磨盘纸(EXAKT 公司，德国)；K1200 磨盘纸(EXAKT 公司，德国)；K4000 磨盘纸(EXAKT 公司，德国)。

1.1.2 标本 比格犬，兔，大鼠的下颌骨、股骨等骨缺损术后，或人工种植体植入后。实验方法为选取在本实验室制作磨片中分别采用纳米羟基磷灰石复合材料修复骨缺损，β-磷酸三钙支架材料修复骨缺损，Bio-oss 骨粉修复骨缺损，带人工种植牙骨组织等多种实验的标本。

1.1.3 试剂 甲苯胺蓝染色液；亚甲基蓝-酸性品红染色液；Goldner’s 三色法染色液。

1.2 方法

1.2.1 组织取材与处理 组织采用EXAKT 300CP 骨组织切割机将骨组织修切成小块，采用中性福尔马林固定。

1.2.2 组织脱水与包埋 取分切后的组织块经梯度酒精脱水，氯仿透明，三次浸润液浸泡，最后用EXAKT E520 光固化包埋机包埋[2]。

1.2.3 切割与磨片 采用EXAKT 300 CP 骨组织切割机将骨组织包埋块切为200μm 厚的薄切片，再用EXAKT 400 CS/ AW 骨组织磨片机，经K320、P800、K1200、K4000 等不同目数的磨盘纸打磨切片，最终磨成25-30μm 厚的磨片。

1.2.4 染色 主要采用Goldner’s 三色法[1，3]、甲苯胺蓝[4]和亚甲基蓝-酸性品红[1，5]等三种特殊染色法进行染色。每张磨片只能使用一种染色方法，具体采用哪种方法染色，根据实验目的来确定。

1.2.5 镜下观察 选取按以上方法处理的磨片，在正置显微镜下观察对比不同染色方法的适用范围。

2. 结果

2.1 带有Bio-oss 骨粉的骨磨片染色 观察带有Bio-oss 骨粉修复骨缺损组织磨片的三种染色方法，染色结果对比，以甲苯胺蓝法染色法为最佳(见图1)。

图1 利用Bio-oss 骨粉修复骨缺损后磨片三种染色(100 倍)

2.2 采用β-磷酸三钙支架材料修复骨缺损的染色 结果显示Goldner’s 三色法染色可以更清晰的观察新生骨生成的层次与过程，同时若辅助以亚甲基蓝-酸性品红染色法，能更全面的得到实验结果(见图2-1，2-2，2-3)。

图2-1 β-磷酸三钙支架材料修复骨缺损磨片三种方法染色(40 倍)

图2-2 β-磷酸三钙支架材料修复骨缺损磨片三种方法染色(100 倍)

图2-3 β-磷酸三钙支架材料修复骨缺损磨片三种方法染色(200 倍)

2.3 采用羟基磷灰石复合材料修复骨缺损成骨实验的染色结果 显示对于类似于这种细颗粒多层支架修复材料来说，成骨是大面积散在的，染色方法应能清晰准确的显示结果，比较后发现，亚甲基蓝-酸性品红染色法较适合于此类研究(见图3-1，3-2)。

图3-1 羟基磷灰石复合材料修复骨缺损磨片三种方法染色(40 倍)

图3-2 羟基磷灰石复合材料修复骨缺损磨片三种方法染色(100 倍)

2.4 显示新骨形成的骨磨片染色 通过对比亚甲基蓝-酸性品红染色法和甲苯胺蓝等两种染色方法，以甲苯胺蓝法为最好，新生骨和成熟骨界限清楚，对比明显(见图4)。

图4 显示区分新生骨与成熟骨的染色方法

2.5 观察种植体骨结合人工种植体植入实验的染色 结果显示，亚甲基蓝-酸性品红染色法能更清晰地反映种植体与骨结合的边界和数量，更有利于计算成骨面积(见图5)。

图5 显示种植体骨结合的染色方法

2.6 同时观察软组织及骨的骨磨片染色 结果表明亚甲基蓝-酸性品红染色法能清晰的显示粘膜、纤维及骨组织(见图6)。

图6 同时观察软组织及骨组织的磨片染色方法

3. 讨论

对于人工种植牙、带荧光标记的骨组织、陶瓷材料以及β-磷酸三钙等材料进行骨缺损修复实验的标本，因其材料的特殊性，不脱钙骨组织磨片是必要的研究手段。在成功制作好骨磨片后，究竟选择哪种或哪几种染色方法来显示实验结果成为一个关键问题。

本实验室在近20 年的实验研究中，特别是近几年来，采用德国EXAKT 公司生产的切磨系统制作骨组织磨片后，对制作好的磨片选择哪种染色方法进行了深入的研究。从各种材料的染色结果中可以看出，不同的实验，因其实验目的的不同，选择材料的不同，实验终结时反映在组织上的结果也是不同的。

对于骨缺损修复支架材料来说，比较常用的基础材料是Bio-oss 骨粉，β-磷酸三钙，羟基磷灰石，只是实验者对其进行一些改性或添加一些复合物，以提高其成骨的效能[6，7]。

Bio-oss 骨粉是口腔科临床常用的成骨材料，作为实验的阳性对照材料来使用，其成骨过程是材料不断降解新骨不断生成，新骨将材料包围最终全部转化为骨组织。从图1 中可以看到，Goldner’s三色法、甲苯胺蓝和亚甲基蓝-酸性品红等三种染色法的染色结果，亚甲基蓝-酸性品红染色后，新生的骨组织包围着骨粉，但新生骨的成骨过程不如甲苯胺蓝法更清楚，Goldner’s 三色法材料与新骨的颜色有些接近，且骨细胞显示不如以上两种明显。通过对比后可以看出对于使用Bio-oss 骨粉修复骨缺损的实验，甲苯胺蓝法染色结果最能达到实验的效果，可以观察到材料降解，以及新骨是如何形成的等多种结果。如经费允许，还可以再辅以亚甲基蓝-酸性品红染色，但不建议采用三色法。

β-磷酸三钙也是口腔、骨科和整形外科常用的骨缺损修复材料[8]，从图2-1 到2-3 不同放大比例结果来看，Goldner’s 三色法的显示结果是，矿化骨和胶原：蓝色；类骨质：红色；胞质：橙色。是三种染色法中最能反映采用β-磷酸三钙支架材料后，骨形成与修复过程的染色方法，从图中可以清楚的显示骨形成的层次和顺序。但因三色法骨细胞为桔红色，不清晰，最好再辅以亚甲基蓝-酸性品红染色，其红色骨与蓝色的成骨细胞和破骨细胞对比明显。

羟基磷灰石是使用历史比较长的骨修复支架材料，现在所使用的多是在原有基础上的改性或添加骨生长因子的复合材料[9]。从图3 中可以看出对于类似这种颗粒层状支架材料来说，其成骨是以散在的片状形式出现，新骨包绕材料生长。三种染色对比发现，亚甲基蓝-酸性品红染色法效果最好，甲苯胺蓝法中材料与新骨对比更明显。在此类研究中，这两种染色方法可以对照来使用。

对于支架材料植入后新骨是否生长，生成了多少新生骨，从图4 的甲苯胺蓝法中可以清楚的看到新生骨与成熟骨的边界，但亚甲基蓝-酸性品红染色法则界限不清。对于人工种植体植入后，种植体与骨结合的情况及面积测量，从图5 中可以清楚的看到，亚甲基蓝-酸性品红染色法更有优势，在仅是观察种植体骨结合的实验中，建议采用此种染色法。在有些种植体植入实验中，同时要观察软组织及骨组织时，比如牙龈组织、粘膜、纤维等。从图6 中也可以看到，亚甲基蓝-酸性品红染色法能清晰的观察粘膜、纤维和牙龈组织，其他两种方法比较模糊，不适合此种研究。

[1] 王东胜，刘洪臣.带种植体骨磨片技术[J].中华老年口腔医学杂志，2009，7(6)：360-362

[2] 王东胜，路正刚. 种植体骨界面组织形态学研究方法探讨[J].中华老年口腔医学杂志，2005，3(3)：142-144

[3] Cruber Helen E. Adaptation of Goldner’s Masson Trichrome stain for the study of undecalcified plastic embedded bone[J].Biotechnic Histochemistry， 1992，67(1)30-34

[4] 廖二元，谭利华. 代谢性骨病学[M].北京：人民卫生出版社，2003：279-283

[5] Doneth K， Breuner G. A method for the study of undecadcified bones and teeth with attached tissues-The sige-Schliff technique[J]. J Oral Pathol，1982，11:318-326

[6] 赵 铮，赵春雨.骨组织工程应用于口腔颌面部骨组织缺损修复研究进展[J].继续医学教育，2015，29(9)：77-79

[7] 张朕坡，张正文.组织工程骨修复下颌骨缺损研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志，2015，29(10)：949-951

[8] 刘星纲，邓旭亮，邹 超，等.多孔β-磷酸三钙/ 胶原支架修复兔下颌牙槽骨缺损的实验研究[J]. 北京口腔医学，2014，22(1)：1-3

[9] 方依婷，曾 艳，张星宇，等.两种羟基磷灰石成骨能力的对比研究[J].解剖学研究，2015，37(4)：268-269