诸力 陈红平 周苏娟 王川丕 刘新

(中国农业科学院茶叶研究所农业部茶叶产品质量安全风险评估实验室(杭州)，杭州310008)

1 引言

草甘膦(Glyphosate)作为无选择类除草剂，以其高效、低毒、廉价等特性被广泛运用于全球各个农业和非农业领域［1］。草铵膦(Glufosinate)可以有效去除绝大部分耐草甘膦杂草，且具有环保易降解等特点而受到各界青睐。随着草甘膦、草铵膦使用频率不断上升，特别是在茶园中的运用日益剧增，其残留问题越来越受到关注，在2013 欧盟农残标准-茶叶中规定，草甘膦和草铵膦最高残留限量(MRL)值分别为2.0 和0.1 mg/kg。草甘膦及其主要降解产物氨甲基膦酸(Aminomethyl phosphonic acid，AMPA)和草铵膦之间化学结构相似，都具有易溶于水，难溶于一般有机溶剂，难挥发，缺少发色和荧光基团等特性，因此运用常规方法进行检测比较困难。

目前，草甘膦检测方法有色谱法(GC［2］、LC［3，4］、IC［5，6］)、分光光度法［7］、质谱法(GC-MS［8］、LC-MSMS［9～11］)及电感耦合等离子光谱法(ICP)［12］等，但大部分方法存在灵敏度低、操作程序繁琐、有机试剂污染严重等缺点，也难以直接运用于茶叶农残检测领域。

茶叶作为有典型基质效应的经济作物，其草甘膦和草铵膦检测文献报道甚少。食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量GB2763-2014 规定，茶叶中草甘膦指定检测方法SN/T 1923-2007 最低定量限为0.1mg/kg，而草铵膦并未指定相应检测标准。本实验通过“碱提酸沉”pH 值调控及Oasis HLB 小柱净化后FMOC-Cl 衍生前处理，采用可编程多反应监测(Scheduled MRM)，建立了一种超高效液相色谱-串联质谱测定不同茶叶(绿茶、红茶、乌龙茶、普洱茶)中草甘膦、氨甲基膦酸及草铵膦的方法。本方法稳定、简便、灵敏，可满足各类茶叶检测需求。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

API 3200 型串联三重四极杆质谱(美国AB 公司);Waters ACQUITY 超高效液相色谱仪(Waters 公司);Mill-Q 去离子水发生器(美国Millipore 公司);Sigma 3-16L 离心机(德国Sigma 公司);Oasis HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg，Waters 公司)。

草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸标准样品(纯度≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司);氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl，不低于98.0%，百灵威公司);甲醇、乙腈(色谱纯，百灵威公司);甲酸铵(99.9%，德国Sigma 公司);甲酸(95%，德国Sigma 公司);KOH(分析纯，杭州萧山化学试剂厂);HCl(36% ～38%，优级纯，江苏永华精细化学品有限公司);硼酸钠(Na2B4O7·10H2O，99.5%，太仓美达试剂有限公司);5%(V/V)硼酸盐缓冲溶液(pH=9)。

茶叶样品来源于浙江省各茶叶市场及各大超市。

2.2 色谱和质谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3 (100 mm × 2.1 mm，1.8 μm);流动相:含0.1%甲酸-1 mmol/L甲酸铵溶液(流动相A)和甲醇溶液(流动相B);梯度洗脱程序:0 ～1 min，10% B;1 ～6 min，10% ～100% B;6 ～6.1 min，100% ～10% B;6.1 ～7.0 min，10% B。流速:0.3 mL/min;进样量:10.0 μL;柱温:40 ℃;运行时间:7 min。

离子源:电喷雾离子源(ESI)，温度500 ℃，电压5500 V;扫描方式:正离子模式;雾化气GS1 压力:50 psi;雾化气GS2 压力:50 psi;定性与定量离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等参数见表1。

表1 草甘膦、草铵膦及氨甲基膦酸衍生物质谱条件参数Table 1 MS conditions for derivatizations of glyphosate，glufosinate and aminomethyl phosphonic acid (AMPA)

2.3 样品制备

提取:称取2.0 g 茶叶试样于50mL 离心管，加入0.05 mol/L KOH 溶液15 mL，摇匀静置20 min。经5000 r/min 离心10 min，过滤，取滤液2 mL 至5 mL 离心管，加入5 mol/L HCl 溶液20 μL，振荡均匀后经5000 r/min 离心10 min，得到上清液。

净化:取1 mL 上清液至Oasis HLB(3 mL/60 mg)小柱(小柱活化:先加2 mL 甲醇淋洗，再加2 mL水活化)，经过柱后，用5 mL 离心管接取净化流出液。

衍生:净化液中加入0.2 mL 硼酸钠缓冲溶液，摇匀后再加入0.1 mL 10 g/L FMOC-Cl 衍生试剂，振荡均匀后静置2 h。将衍生后液体试样10000 r/min 离心10 min，经0.22 μm 水系滤膜，供液相色谱-串联质谱分析。

2.4 标准曲线制作

分别称取3 种标准品各0.05 g，用水溶解并定容至50 mL 塑料容量瓶，分别配制成1000 mg/L 标准溶液，4 ℃下保存待用。

标准曲线的配制:采用空白茶叶(绿茶、红茶、乌龙茶、普洱茶)，经2.3 节提取净化，分别配制成6 个不同浓度浓度(5 ～1000 μg/L)的基质标样，现配现用。

2.5 标准加入回收实验

称取不同茶叶空白样2 g，分别添加当量为0.1、0.4 和4.0 mg/kg 混合标准溶液，每个浓度水平重复6 次，经2.3 节提取净化处理，采用各茶叶基质标准曲线进行外标法定量，计算回收率、相对标准偏差和定量限。

3 结果与讨论

3.1 质谱和色谱条件优化

分别取草甘膦、草铵膦及氨甲基膦酸浓度为8 mg/L 标样进行衍生，用于衍生化合物质谱条件优化。本研究采用ESI+模式，选择各准分子离子［M +H］+作为母离子，进行二级质谱优化，参数包括电喷雾电压、碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)、电离温度等，优化结果见表1。采用可编程多反应监测(Sched-uled MRM，SMRM)，该模式可以不分时间段同时进行多种残留农药检测，极大提高了MRM 检测通量，有效改善峰形，提高重现性［13］。

研究表明，3 种衍生化合物在HSS T3 柱中的保留强度优于普通C18柱，故予以采用。流动相优化包括甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(0.1%甲酸和1 mmol/L 甲酸铵)、乙腈-水(0.1%甲酸和1 mmol/L 甲酸铵)。结果表明，采用甲醇-水(0.1%甲酸和1 mmol/L 甲酸铵)作为流动相可提高目标化合物离子化效率，缓冲体系进一步增加系统稳定性，3 种化合物分离度和灵敏度都达到最佳。采用2.2 节梯度程序洗脱，不断增加流动相中甲醇的比例，有助于降低基质对目标化合物检测干扰，同时可有效减少杂质对色谱柱的污染［14］。图1 为0.04 mol/L 绿茶基质标准溶液(A)、空白绿茶样品溶液(B)、加标0.4 mg/kg 绿茶样品溶液(C)中3 种衍生化合物的二级质谱总离子流色谱图。由图1 可见，分离效果良好，目标化合物出峰段杂质干扰较小。

图1 0.04 mol/L 绿茶基质标准溶液(A)、空白绿茶样品溶液(B)、添标0.4 mg/kg 绿茶样品溶液(C)中3 种衍生化合物的二级质谱总离子流图Fig.1 MS/MS total ion chromatograms of derived compounds in matrix standard solution (A)，blank solution (B)and 0.4 mg/kg spiked concentration levels (C)of green tea

3.2 前处理条件优化

草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸都属于强极性化合物，通常采用纯水或水/二氯甲烷混合作为提取溶剂［15］。由于茶叶富含色素、糖、氨基酸、多酚类等大量水溶性杂质，采用纯水提取时，会导致提取液成分复杂，目标化合物离子化效率过低［16］，方法定量限难以满足检测要求。本实验经比较后选择强碱溶液，主要原因是:在碱性环境下，弱酸性草甘膦等会反应生成相应盐，可提高其溶解率，而且茶多酚更易氧化生成沉淀，达到初步净化目的。

在提取率研究方面，本研究将预先筛选的阳性绿茶样品A(含草甘膦和氨甲基膦酸)和B(含草铵膦)作为提取实验试样。以下各分析均设定以最理想条件下所测定值(Relative detection value)为1 作为衡量标准。对样品A 和B 分别进行0 ～10 mol/L 不同浓度KOH 溶液进行提取，并且添加相应浓度HCl 溶液，用以调节pH 值至中性而不影响衍生效率。如图2 所示，采用纯水作为提取溶液，效果不理想，A和B 样品中3 种化合物草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸测定结果仅为0.31，0.42，0.38;0.05 mol/L KOH 提取效果最优。

利用HCl 调节pH 值，按照2.3 节提取，离心后取上清液2 mL，分别添加0 ～5 mol/L HCl 溶液0.1 mL，调至中性。如图2 所示，在HCl 浓度为1 mol/L 时，实测值最高，而未添加HCl 溶液组测定结果为0.56，0.65，0.63。造成该结果原因可能是:HCl 打破了原有茶汤中的电解质平衡，在离子效应、电解质作用和共沉效应等共同作用下，茶多酚、氨基酸、糖类等聚合成大分子物质形成络合物而沉淀［17］，净化效果提高。

图2 不同浓度KOH 提取(a)和不同浓度HCl 调控(b)对3 种化合物相对测定值的影响Fig.2 Detectable results of three compounds (a)extracted by different concentrations of KOH and(b)regulated by different concentrations of HCl

本研究选择Oasis HLB(3 mL/60 mg)小柱，其填料为亲水亲脂的反相吸附剂，由N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性二乙烯基苯聚合而成，已在抗生素［18］、激素［19］等检测领域广泛运用。分别将50 和500 μg/L的3 种化合物溶剂标样通过HLB 小柱净化，测得回收率在92.3% ～106.9%之间，说明该小柱并未对3 种化合物产生吸附，因此本方法直接接取净化流出液进行衍生［9］，省去传统洗脱、浓缩等步骤，缩短操作流程。通过测定过柱前后茶叶提取液发现，该过程中去除了95.6%茶多酚、90.4%咖啡碱及53.2%氨基酸，证明净化效果良好。

FMOC-Cl 衍生机制［11，20］是在碱性环境(pH=9)下通过FOMC-基团取代目标化合物氮原子上的氢，从而生成较稳定的化合物FOMC-R。在不同茶叶基质中添加过量衍生试剂条件下，对衍生反应时间、温度及pH 值进行优化，结果表明，反应2 h 后，测得衍生化合物无明显增加，改变温度对衍生率影响不大，pH=9 时衍生率最佳。

3.3 线性范围、相关系数和基质效应评价

采用2.4 节中制备的各基质混合标准溶液，按优化后检测条件进样，以各定量离子对峰面积对应浓度做标准曲线，得到3 种化合物线性方程及其相关系数。由表2 可见，3 种化合物在5 ～1000 μg/L 浓度范围内线性良好(R2＞0.99)。草甘膦和草铵膦衍生物在不同基质中基质效应(Matrix effect，Me)不明显，范围在89.7% ～103.3%之间。氨甲基磷酸衍生物在绿茶中无明显基质效应，但在乌龙茶和普洱茶中Me 分别为73.8%和76.4%，其中基质抑制最强为红茶，Me 达60.2%，原因可能是茶叶经不同程度发酵产生的色素等会对目标化合物测定产生影响。为消除基质效应干扰，本研究采用相应基质匹配标样进行校准。

表2 不同茶叶基质中3 种化合物的线性方程、相关系数及添标回收率、精密度和方法定量限(n=6)Table 2 Linear equations，correlation coefficients，average recoveries，relative standard deviation(RSD)，and limit of quantification(LOQ)of three compound in different matrix(n=6)

3.4 回收率、精密度和方法定量限

取不同茶叶2 g，分别添加0.1，0.4 和4 mg/kg 混合标样，按照前述方法处理平行测定6 次，回收率和精密度见表2。不同茶叶基质中3 种化合物添标回收率范围在72.1% ～109.9%之间，RSD(n =6)在0.5% ～9.8%之间，表明所建方法重复性良好。以10 倍信噪比(S/N)计算方法定量限(LOQ)在0.03 ～0.08 mg/kg 之间。

3.5 实际样品分析

运用此方法对市场247 份样品进行测试，其中绿茶146 份、红茶44 份、乌龙茶42 份、普洱茶15 份。测试结果，草甘膦和草铵膦检出样品分别为46 份和4 份，目标物含量范围为0.105 ～3.223 mg/kg 和0.124 ～1.351 mg/kg(统一检出限为0.1 mg/kg)。本方法可满足欧盟对茶叶制定农药最高残留限量(MRLs)要求，为茶叶行业中制定相关检测标准提供了理论依据。

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