陈国妮，孙飞龙，闫亚茹，侯甜甜，文改改

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安 710048）

响应面法优化马齿苋类黄酮超声微波提取工艺

陈国妮，孙飞龙，闫亚茹，侯甜甜，文改改

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安 710048）

在单因素实验的基础上，利用中心组合实验设计原理，采用响应面分析法，并利用Design Expert软件优化提取工艺参数.结果表明，最佳提取条件为乙醇体积分数85%、提取时间40min、料液比1∶25时，总黄酮提取量10.363 8mg／g与理论预测值10.370 3mg／g接近.响应面法可用于优化马齿苋类黄酮超声微波联用提取工艺，其优化工艺参数可为马齿苋类黄酮工业化生产提供参考.

马齿苋；类黄酮；超声－微波联用；响应面法；提取工艺

马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科一年生草本植物，药食两用，肥厚多汁，无毛，生于田野路边等向阳处，我国南北各地均有分布.现代研究表明，马齿苋不但含有丰富的脂肪酸及维生素等营养成分［1］，此外，根据相关文献记载马齿苋还含有多种活性物质，包含生物碱、类黄酮（也叫黄酮类化合物）、多糖、甾醇、有机酸、苷类、酚类化合物及油脂等成分［2］.马齿苋含有较多的活性成分，使其具有多样的活性功能，尤其是活性成分中的类黄酮，具有较强的抗菌抑菌、抗氧化和抗癌等多种药效功能，因此有一定开发利用的必要［3］.目前，已见报道提取马齿苋类黄酮的方法主要有溶剂提取法［4］、超声波辅助提取［5］和微波辅助提取［6］等，文献［7］使用超声波法提取黄皮叶中的黄酮类化合物，结果显示与常规的浸提法相比，超声波法能缩短处理的时间.针对目前的类黄酮提取方法普遍存在提取效率不高等不足问题，微波－超声波联用提取法作为一种高效绿色环保的高新技术，具有提取率高、工艺简单、污染小、低耗能和避免了对有效成分的不良影响等优点［8］.

本文采用超声－微波联用提取法，运用响应面分析方法，研究超声－微波联合辅助技术提取马齿苋类黄酮的最佳工艺，以便为马齿苋进一步分离纯化和各性能的研究奠定基础，最终实现对其大规模开发利用和产业化.

1 实 验

1.1 材料与方法

1.1.1 试剂与仪器 马齿苋：采自西安市市郊.无水乙醇、氨水、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯.立式电热鼓风干燥箱：DGF－1AB型，天津市泰斯特仪器有限公司；电子天平：AL204，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；紫外可见分光光度计：752N型，上海精密科学仪器有限公司制造；旋转蒸发仪：申科R－205型，上海申顺生物科技有限公司；微波炉：KD21C－C2型，顺德市美的微波炉制造有限公司；超声波清洗器：SK5200LH型，上海科导超声仪器有限公司；多功能粉碎机：XS－04型，上海兆申科技有限公司；循环水式真空泵：SHZ－D（Ⅲ）型，巩义市英峪予华仪器厂.

1.1.2 方法 （1）原料的预处理.马齿苋除去残根杂质，洗净，自然阴干后置于65℃烘箱中烘干.取出，用多功能粉碎机粉碎，过60目筛成干粉，备用.（2）马齿苋类黄酮的提取与测定.马齿苋类黄酮的提取：称取马齿苋干粉1.0g放入250mL锥形瓶中，加入30mL的95%乙醇，在室温下浸泡并摇匀，在50W的微波炉加热10min，再放到50W的超声波清洗器超声30min.用真空泵抽滤处理后的马齿苋乙醇提取液，滤液用旋转蒸发仪浓缩（温度70℃），获得马齿苋黄酮浓缩液，密封保存［9］.

类黄酮定性检测：将提取液点于滤纸片上，置于氨水瓶口，显微黄色，移开滤纸片数分钟后，微黄色又消褪，说明该提取物中含有类黄酮存在［10］.

马齿苋总黄酮得率计算.取芦丁标准品10mg，用70%乙醇定容于10.0mL的容量瓶，配成标准溶液，进行比色测定并绘制标准曲线［11］.移取1.0mL黄酮提取液于10.0mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.4mL，静置5min，10%硝酸铝溶液0.4mL，静置5min，4.2%氢氧化钠溶液4.0mL，加蒸馏水标定至刻度，摇匀，放置15min，以不加黄酮的混合溶液作为参比，依次加入样品液，在波长510nm下测其吸光度，带入标准曲线方程，计算总黄酮的浓度，按式（1）得到总黄酮提取率（Y）.测定标准品芦丁质量浓度C（g／L）与吸光度A所得标准曲线方程为C＝0.092 5A＋0.000 2，R2＝0.999 8.Y＝10×C×V／m.（1）

其中：Y为总黄酮得率（mg／g）；C为吸光度A时由标准曲线方程计算出样品液的质量浓度（g／L）；V为样品液的体积（mL）；m为称取样品的质量（g）.

1.2 单因素实验对马齿苋总黄酮提取条件的影响

1.2.1 乙醇体积分数的影响 依据方法1.1.2（2），在料液比1∶25，提取时间35min分析乙醇体积分数分别为75%，80%，85%，90%和95%对马齿苋黄酮类化合物得率的影响.

1.2.2 提取时间的影响 依据方法1.1.2（2），在料液比1∶25，乙醇体积分数80%，分析提取时间分别为30min，35min，40min，45min和50min对马齿苋总黄酮得率的影响.

1.2.3 料液比的影响 依据方法1.1.1（2），在乙醇体积分数80%，分析料液比分别为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30对马齿苋总黄酮得率的影响.

1.3 响应面法优化马齿苋中总黄酮的提取条件

在单因素实验的基础上，采用中心组合Box－Behnken［12－13］设计方案，设计的因素水平见表1，采用响应面法分析该三因素对总黄酮得率的影响，并优化其提取条件.

表1 中心组合Box－Behnken因素水平表Table 1 Center combination Box－Behnken factors level table

2 结果与讨论

2.1 乙醇体积分数对马齿苋总黄酮得率的影响

不同乙醇体积分数对总黄酮得率的影响不同，测定结果如图1所示.从图1可以看出，总黄酮得率随乙醇体积分数的增大而增大，但当乙醇体积分数大于80%时，总黄酮得率开始下降.根据溶液的相似相溶原理，在乙醇体积分数为80%时，总黄酮能最大溶出，得率达到最大，与黄酮极性相关.

2.2 提取时间对马齿苋总黄酮得率的影响

不同提取时间对马齿苋总黄酮得率的影响结果如图2所示.由图2可以看出，在35min之前，总黄酮得率随提取时间的增加而上升，提取时间达到35min时，总黄酮得率达到最大.原因为超声－微波对马齿苋细胞壁破坏效果较佳，35min之后总黄酮得率逐渐下降，说明细胞破碎已基本完成；同时也可能是黄酮随时间被氧化所致.若再增加时间会加大成本，所以选时间为35min.

图1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig.1Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of total flavones

图2 提取时间对总黄酮得率的影响Fig.2Effect of extraction time on the extraction rate of total flavones

图3 料液比对总黄酮得率的影响Fig.3Effect of solid liquid ratio on the extraction rate of total flavones

2.3 料液比对马齿苋总黄酮得率的影响

不同料液比对马齿苋总黄酮得率的影响结果如图3所示.从图3可以看出，在料液比为1∶25时，总黄酮的得率达最大；料液比再减小，总黄酮得率略有下降.由物质的溶解性可知，溶剂增多时，总黄酮的溶出率达到动态平衡，黄酮的提取率变化不大，同时从经济利益出发，料液比选取1∶25较为适宜.

2.4 响应面法优化马齿苋中总黄酮的提取条件

采用Box－Behnken进行实验设计，设计参数及结果见表2.从表2可以看出，以乙醇体积分数Z1、提取时间Z2、料液比Z3为自变量，总黄酮得率Y为响应值，采用Desinger Expert软件对响应面分析.响应值Y与编码（coded）自变量Z1，Z2，Z3拟合得到响应面的二次方程为

表2 响应面分析方案及结果Table 2 Analysis methods and results of the response surface

表3 回归模型方差分析及结果Table 3 Variance analysis and results for regression equation of model

2.5 响应面实验设计及结果

从表3可以看出，模型中一次项Z1，Z2，Z3极为显著，二次项Z2Z3，Z22显著，Z12，Z32极为显著；整体模型的显著水平P＜0.000 1，表明该模型极显著.Pred（R2）为0.948 7而Adj（R2）是0.989 9，说明拟合的模型方程较好，该模型可以用来指导实际实验.

2.6 各因素相互作用对总黄酮得率的影响

乙醇体积分数Z1、提取时间Z2、料液比Z3三因素对提取率Y的响应面图如图4所示.从响应面3D图的最高点和等值线可以看出，有极值存在于所选范围内，是响应面的最高点，也是等值线最小椭圆的中心点；从响应面图的陡势可以看出，提取时间与料液比相互作用的曲面变化显著，即对总黄酮得率影响最大.

图4 各因素对提取率的响应面图Fig.4The response surface plots of three effects on the extraction rate

2.7 条件优化与验证

通过Design Expert软件得到的最优提取工艺条件为乙醇体积分数83.46%，提取时间39.89min，料液比1∶25，理论得率为10.370 3mg／g.不足之处是所测的马齿苋黄酮提取率较高，因为本实验采用乙醇为提取剂，乙醇的极性大，把叶绿素等成分提取了出来，这就造成所测吸光值较大，因此计算出的马齿苋总黄酮得率偏大.

2.8 确定最佳提取工艺

通过Design Expert软件得到的最佳提取工艺条件：乙醇体积分数85%，提取时间40min，料液比1∶25，实验所得结果为10.363 8mg／g，实际得率与理论得率相误差为0.06%，二者极为接近.

3 结 论

（1）采用超声－微波联用法提取马齿苋类黄酮，总黄酮得率有所提高.该方法具有高效、快捷、低耗能、小成本，对提取物活性成分影响小等特点.

（2）文中所选的响应面优化手段较于其他方法具有可研究多因素间的交互作用，实验次数少、周期短，所求得回归方程精度高，分析结果更加清晰直观等优点，为今后天然活性物质的提取提供一定的参考与指导作用，实用性较高.

（3）在3个单因素实验基础中，以总黄酮得率为响应值，运用响应面分析法得到最优提取工艺条件为乙醇体积分数85%，提取时间40min，料液比1∶25.

［1］ OLIVEIRA Ivo，VALENTAO Patricia，LOPES Rosario，et al.Phytochemical characterization and radical scavenging activity of portulaca oleraceae leaves and stems［J］.Microchemical Journal，2009，92（2）：129－134.

［2］ 李玉萍，曾宪伟，叶军，等.马齿苋活性成分体内外抗癌作用的初步筛选［J］.时珍国医国药，2009，20（11）：2726－2728.

LI Yuping，ZENG Xianwei，YE Jun，et al.Screening antitumor effect of active constituents from ortulaca oleracea in vitro and vivo［J］.LI Shizhen Medicne and Materia Medica Research，2009，20（11）：2726－2728.

［3］ 朱丽，徐为公，赵广荣.马齿苋的研究现状与综合开发利用［J］.河北林果研究，2006，21（12）：198－201.

ZHU Li，XU Weigong，ZHAO Guangrong.Research progress and comprehensive utilization of Portulaca oleracea L［J］.Hebei Journal of Forestry and Orchard Researh，2006，21（12）：198－201.

［4］ 吴昊，宗志敏，张赣道.响应面法优化陈皮黄酮提取工艺的研究［J］.安徽农业科学，2012，40（28）：13985－13987.

WU Hao，ZONG Zhimin，ZHANG Gandao.Optimization of the extraction technology of flavonoids from citrus peels by response surface methodology［J］.Journal of Anhui Agricultural，2012，40（28）：13985－13987.

［5］ 吴现芳，赵成爱，余梅燕，等.响应面法优化八宝景天叶总黄酮的超声提取工艺［J］.食品工业科技，2013，34（1）：224－228.

WU Xianfang，ZHAO Chengai，YU Meiyan，et al.Optimization of ultrasonic－assisted extraction of total flavonoids from leaves of sedum spectabile boreau by response surface methodology［J］.Science and Technology of Food Industry，2013，34（1）：224－228.

［6］ 李杏元，陈国安.微波辅助提取葛根黄酮工艺的优化［J］.湖北农业科学，2012，51（16）：3572－3574.

LI Xingyuan，CHEN Guoan.Optimization of microwave－assisted extraction process of flavonoids from radix puerariae［J］.Journal of Hubei Agricultural Sciences，2012，51（16）：3572－3574.

［7］ 周燕芳.超声波法提取黄皮叶中黄酮工艺的优化［J］.湖北农业科学，2012，51（7）：1433－1435.

ZHOU Yanfang.Optimization of ultrasonic－assisted method of flavonoid leaf of clausena lansium［J］.Journal of Hubei Agricultural Sciences，2012，51（7）：1433－1435.

［8］ 曾里，夏之宁.超声波和微波对中药提取的促进和影响［J］.化学研究与应用，2002，14（3）：245－249.

ZENG Li，XIA Zhining.The improvement and influence of ultrasonic and microwave irradiation on the extraction of traditional Chinese medicine［J］.Chemical Research and Application，2002，14（3）：245－249.

［9］ 黄泽元，王海滨，刘志伟.芝麻叶中总黄酮的最佳提取工艺研究［J］.农业工程学报，2004，20（6）：201－204.

HUANG Zeyuan，WANG Haibin，LIU Zhiwei.Optimum extraction technology of flavonoids in sesame leaves［J］.Transactions of the CSAE，2004，20（6）：201－204.

［10］ CHEN Haiguang，YU Yigang.Study on extraction of flavonoids and alkaloid in lotus leaf［J］.Food Science.2002，23（10）：69－72.

［11］ 祁英，丁江涛，苏景秀，等.洋葱中黄酮类化合物的分布及其抗氧化活性的研究［J］.中国食物与营养，2010，23（5）：67－71.

QI Ying，DING Jiangtao，SU Jingxiu，et al.Study on the contents of flavonoids in different part of onions and its antioxidant activity［J］.Food and Nutrition in China，2010，23（5）：67－71.

［12］ YAMAZAK I，KUSHIDA N，OGUCHI A，et al.Response surface design and analyses［M］.New York：Marcel Dekker Inc，1987：149－205.

［13］ 秦学会，阮美娟.响应面法优化超声波水提马齿苋黄酮的工艺［J］.天津科技大学学报，2009，24（1）：19－21.

QIN Xuehui，RUAN Meijuan.Optimization of ultrasonic response surface method purslane flavone technology［J］.Journal of Tianjin University of Science ＆Technology，2009，24（1）：19－21.

编辑、校对：田莉

Optimization of ultrasonic－microwave extraction process of flavonoids from purslane by response surface methodology

CHEN Guoni，SUN Feilong，YAN Yaru，HOU Tiantian，WEN Gaigai

（School of Environmental ＆Chemical Engineering，Xi′an Polytechnic University，Xi′an 710048，China）

The response surface methodology was used according to the principle of central composite design on the basis of single factor test，and the optimum extraction process parameters were obtained by the software of Design Expert as follows：the ethanol volume fraction was 85%，the extracting time 40min，and the liquid solid ratio 1∶25.Under these conditions，the value of flavone extraction yield was 10.363 8mg／g，which approximates the predicted value 10.370 3mg／g.The results indicate that the response surface methodology can be used to optimize the ultrasonic－microwave assisted extraction process of flavonoids from purslane and the optimized extraction process parameters can be offered as a reference for industrial production of flavonoids from purslane.

purslane；flavonoids；ultrasonic－microwave assisted extraction；response surface methodology；extraction process

Q949.745.6；R284.2

A

1674－649X（2015）05－0555－06

10.13338／j.issn.1674－649x.2015.05.007

2015－01－06

陕西省教育厅科研计划资助项目（15JK1315）

孙飞龙（1975—），男，山西省运城市人，西安工程大学副教授，博士，研究方向为天然活性物质的提取.E－mail：sunfeilong＠xpu.edu.cn