马晓珂,王振斌,朱梦昕,林晓明,王 林,王 干

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

蛋白酶法制备芝麻饼粕蛋白质的工艺研究

马晓珂,王振斌*,朱梦昕,林晓明,王 林,王 干

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

以脱脂后的芝麻饼粕为原料,采用酶法提取法制备芝麻饼粕蛋白质。在单因素实验的基础上,通过正交实验确定蛋白酶法制备芝麻饼粕蛋白质最佳工艺条件为:酶解时间45min,pH9,酶解温度50℃,加酶量4000U/g,液料比20∶1。在此最佳条件下,芝麻饼粕蛋白质提取率为80.12%。所得产品蛋白质含量为67.89%。

蛋白酶法,芝麻饼粕,蛋白质,提取

我国芝麻饼粕资源丰富[1],且芝麻饼粕蛋白质氨基酸组成合理,是一种很好的蛋白质资源[2]。分离制备植物蛋白质的方法多种多样,例如碱溶酸沉法、酶解法、反胶束法、膜分离法等[2-3],目前国内外研究蛋白质提取的方法主要为碱提法和酶解法两种。碱提法具有操作简单、易于控制、成本低廉等优点,但强碱易产生赖氨酰丙氨酸这些有毒物质,引起营养物质的损失,同时还会使蛋白质变性和水解,增强了美拉德反应,影响产品色泽,造成蛋白质商用品质降低[4]。用蛋白酶法提取蛋白质,反应条件温和、副反应少,不破坏氨基酸,且不污染环境,对蛋白质有改性作用,蛋白质经酶水解有助于拓宽蛋白质的应用范围[5]；酶能使蛋白质水解成肽和氨基酸,易于肠道消化吸收,同时能提高和改善蛋白质的溶解性、乳化性、起泡性、黏度[1]；酶法水解能避免酸法水解或碱法水解对氨基酸的破坏作用和变旋作用[6],以保证蛋白质质量。

芝麻蛋白质主要是碱溶性蛋白质,约占67%,因此采用碱性蛋白酶进行酶解[7]。本研究以芝麻饼粕为原料,采用碱性蛋白酶水解法提取蛋白质,确定蛋白酶提取芝麻饼粕蛋白质的最佳工艺参数,以期为芝麻饼粕蛋白质的深加工利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

芝麻饼粕 由新沂吉顺昌油脂科技有限公司提供,测得其中粗蛋白质35.99%,粗脂肪15.28%,水分8.48%,灰分9.96%,其他成分35.61%。

碱性蛋白酶 购于无锡杰能科生物工程有限公司,根据Folin-酚法(SB/T 10317-1999)计算出酶活为140.532U；分析纯试剂:氢氧化钠、盐酸、硼酸、硫酸、硫酸铜、硫酸钾 购于国药集团化学试剂公司。

Fz-4药物粉碎机 温岭市百乐粉碎设备厂；pH5-3C型pH计 上海理达仪器厂；HH-A恒温水浴搅拌锅 江苏金坛市中大仪器厂；SPF401F电子天平 奥豪斯国际贸易(上海)中国有限公司；TGL-16高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；FOSS 2100型凯氏定氮装置 上海新嘉电子有限公司。

1.2 蛋白酶法制备芝麻饼粕蛋白质的工艺

称取粉碎过80目筛的芝麻饼粕粉若干克,加入100mL的去离子水配成相应浓度的溶液,调节pH至一定值,调节温度后加入一定量的碱性蛋白酶。反应过程中经常以1mol/L NaOH调节反应体系pH,反应结束后,100℃灭酶15min,冷却后4500r/min离心20min,下层沉淀再加5倍体积去离子水搅拌10min后离心,合并三次上清液,真空浓缩、冷冻干燥即得芝麻饼粕蛋白质产品[8]。测定其蛋白质含量,并计算蛋白质提取率。

1.3 蛋白酶法制备芝麻饼粕蛋白质的单因素设计

在碱性蛋白酶酶解芝麻饼粕的过程中,分别研究酶解时间(15、30、45、60、75、90min)、pH(7、8、9、10、11)、酶解温度(30、40、50、60、70℃)、加酶量(1000、2000、3000、4000、5000U/g芝麻粕)及液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1mL/g)对蛋白质提取率的影响。

1.4 蛋白酶法制备芝麻饼粕蛋白质的优化设计

根据单因素实验结果,选取酶解时间、pH、酶解温度、加酶量为因素,采用正交实验的方法,进行四因素三水平设计(见表1)。通过对实验数据的分析,得出最优参数。

表1 正交实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

1.5 蛋白质提取率和蛋白质得率的计算

采用半微量凯式定氮法测定蛋白质含量,用式(1)计算芝麻饼粕蛋白质提取率:

式(1)

1.6 基本化学成分的测定

粗蛋白质测定:凯氏定氮法(GB5009.5-2003)；

粗脂肪测定:索氏抽提法(GB5009.6-2003)；

水分测定:恒重法(GB5009.3-2003)；

灰分测定:高温灼烧法(GB5009.4-2003)。

2 结果与分析

2.1 碱性蛋白酶水解提取芝麻饼粕蛋白质的单因素实验

2.1.1 酶解时间对碱性蛋白酶提取芝麻饼粕蛋白质的影响 在液料比20∶1,酶解pH9、加酶量3000U/g、酶解温度50℃条件下,考察酶解时间对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响,结果如图1所示。

由图1可知,芝麻饼粕蛋白质提取率随着时间的增加而升高。当酶解时间为30min时蛋白质提取率达到76.56%,此后随着酶解时间的继续增大芝麻饼粕蛋白质提取率增加缓慢。分析原因认为碱性蛋白酶在反应初期酶活力较高,能够和蛋白质完全作用,而且不存在产物抑制作用；随着时间的延长,酶构象发生改变,酶活力逐渐下降,同时水解物中产生了抑制酶促反应的产物,因此蛋白质提取率的增加变得缓慢。综合考虑能耗和效率,所以选取酶解时间30min作进一步优化。

图1 酶解时间对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of hydrolysis time on extraction rate of sesame cake protein注:标有不同小写字母者表示组间差异显著(p<0.05), 而标有相同字母者表示组间差异不显著(p>0.05),以下类同。

2.1.2 pH对碱性蛋白酶提取芝麻饼粕蛋白质的影响 在液料比20∶1、加酶量3000U/g、酶解温度50℃、酶解时间30min条件下,考察pH对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响,结果如图2所示。

图2 pH对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of pH value on extraction rate of sesame cake protein

由图2可知,pH对碱性蛋白酶提取芝麻饼粕蛋白质的影响显著(p<0.05)。在pH7～11范围内芝麻饼粕蛋白质提取率随pH的增加先上升后下降,其中在pH9时蛋白质提取率最高,为76.56%。这是因为碱性蛋白酶的最适pH为9,超出这个范围,酶的活性降低,提取率下降。pH影响酶活力的原因主要有3个方面:过酸或过碱使酶的空间结构破坏,引起酶构象的改变,导致酶活性丧失；当pH改变不很剧烈时,酶虽然未变性,但pH可影响底物的解离状态、影响酶分子活性部位上有关基团的解离,从而影响与底物的结合或催化;pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离,从而影响了酶活性部位的构象,进而影响酶的活性[8-9]。因此,本实验选取pH9作进一步优化。

2.1.3 酶解温度对碱性蛋白酶提取芝麻饼粕蛋白质的影响 在液料比20∶1、酶解pH9、加酶量3000U/g、酶解时间30min条件下,考察酶解温度对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响,结果如图3所示。

由图3可知,酶解温度对碱性蛋白酶提取芝麻饼粕蛋白质的影响显著(p<0.05)。在温度30～70℃范围内,芝麻饼粕蛋白质提取率随温度的升高先上升后下降,其中在50℃时蛋白质提取率最高。分析原因认为酶具有最适温度,温度提高会影响酶的稳定性和底物转变成产物的速度。当温度低于最适温度时,提高温度能增大酶活力,加快反应速率,因此蛋白质提取率提高。当温度超过最适温度后,蛋白质提取率降低,可能是因为碱性蛋白酶因受热出现部分变性,活性逐渐降低[10-11]。因此,选择50℃作进一步优化。

图3 酶解温度对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on extraction rate of sesame cake protein

2.1.4 加酶量对碱性蛋白酶提取芝麻饼粕蛋白质的影响 在液料比20∶1、酶解pH9、酶解温度50℃、酶解时间30min条件下,考察酶解温度对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响,结果如图4所示。

图4 加酶量对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of enzyme does on extraction rate of sesame cake protein

由图4可知,随着加酶量的增大,芝麻饼粕蛋白质提取率不断增高。在3000U/g之前,蛋白质提取率明显增加,但当超过3000U/g 时,蛋白质提取率增加缓慢。分析原因认为在底物分子过饱和的情况下,底物转化为产物的速率随着加酶量的增大而增大；当加酶量增大到一特定值,所有的底物分子与酶分子已经充分结合,此时继续增大加酶量对反应速率影响很小,因而蛋白质提取率变化很小[12-13]。综合考虑酶作用的效率与经济成本,选择加酶量3000U/g作进一步优化。

2.1.5 液料比对碱性蛋白酶提取芝麻饼粕蛋白质的影响 在酶解pH9、加酶量3000U/g、酶解温度50℃、酶解时间30min条件下,考察液料比对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响,结果如图5所示。

图5 液料比对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响Fig.5 Effect of solvent/meal ratio on extraction rate of sesame cake protein

由图5可知,随着液料比的增大,芝麻饼粕蛋白质提取率不断增大。在液料比20∶1之前蛋白质提取率增加较快,但当超过20∶1后蛋白质提取率增加缓慢。分析原因认为当液料比较低时,提取体系黏度较大,影响底物分子在溶液中的扩散运动,不利于底物与酶的结合；随着液料比的增加,底物分子流动速率增大,促进酶与底物充分接触,进而提高了蛋白质的提取率。继续增大液料比,蛋白质已经几乎完全溶出,因此提取率增加缓慢,且过大的料液比不利于蛋白质提取后的浓缩沉淀。结合提取的经济性考虑,本实验选取液料比20∶1作为进一步蛋白质的优化研究,不再参与优化。

2.2 正交实验优化蛋白酶法制备芝麻饼粕蛋白质的酶解工艺

实验结果见表2。

由表2极差分析可知,影响碱性蛋白酶酶解芝麻饼粕制备蛋白质的主要因素是pH,其次是酶解时间,再次为酶解温度,影响最小的为加酶量。影响碱性蛋白酶制备芝麻饼粕蛋白质的主次因素顺序为:pH(B)>酶解时间(A)>酶解温度(C)>加酶量(D)。由实验结果可知,碱性蛋白酶酶解芝麻饼粕制备蛋白质的最优工艺组合为A3B2C2D3,即酶解时间45min,pH9,酶解温度50℃,加酶量4000U/g,液料比20∶1。并对该工艺进行验证实验,3次平行实验芝麻饼粕蛋白质提取率分别为80.55%、79.75%、80.06%,其平均提取率80.12%。

表2 正交实验表 L9(34)及结果Table 2 Orthogonal test and its results L9(34)

注:正交结果中的提取率均为三次平行实验的平均值。

表3 芝麻饼粕蛋白质基本成分及含量(%)Table 3 Proximate composition of sesame cake(%)

2.3 蛋白酶法制备的芝麻饼粕蛋白质基本成分的测定

根据正交实验结果,选用确定的工艺条件提取芝麻饼粕蛋白质,将提取的芝麻饼粕蛋白质溶液经真空浓缩后冷冻干燥得到芝麻饼粕蛋白质产品,测定的基本成分及含量见表3。由表3可知,碱性蛋白酶酶解制备的芝麻饼粕蛋白质产品粗蛋白质含量为67.89%。

3 结论

以芝麻饼粕为原料,采用碱性蛋白酶酶解法制备芝麻饼粕蛋白质。在单因素实验的基础上,通过正交实验确定最佳工艺条件为:酶解时间45min,pH9,酶解温度50℃,加酶量4000U/g,液料比为20∶1,蛋白质的提取率达到80.12%,所得产品蛋白质含量为67.89%。

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Enzymatic preparation of protein from sesame cake

MA Xiao-ke,WANG Zhen-bin*,ZHU Meng-xin,LIN Xiao-ming,WANG Lin,WANG Gan

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

The technical parameters of protein extracting from industrial sesame cake by means of alkaline proteinase method extraction were established. After single factor tests and orthogonal test,the optimum parameters of alkaline proteinase method were as follows:hydrolysis time 45min,pH9,hydrolysis temperature 50℃,enzyme does 4000U/g,solvent/meal ratio 20∶1,and the extraction rate of sesame cake protein was 80.12%. The content of sesame cake protein was 67.89%.

alkaline proteinase;sesame cake;protein;extraction

2014-05-05

马晓珂(1974-)，女，硕士，实验师，研究方向：天然产物有效成分分离与应用。

*通讯作者:王振斌(1975-) ，男，博士，副教授，研究方向: 天然产物分离及应用。

江苏省科技支撑项目(BC2012421)；江苏高校优势学科建设工程资助项目; 江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目；江苏大学大学生科研立项资助项目(12A018)。

TS229

B

1002-0306(2015)03-0246-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.043