韦正鑫,刘世尧,卞京军,蔡 娟,潘雪珍,张 丹,白志川

(西南大学园艺园林学院,重庆北碚 400715)

重庆皱皮木瓜果渣总黄酮提取工艺优化研究

韦正鑫1,刘世尧2，*,卞京军2,蔡 娟2,潘雪珍2,张 丹2,白志川2，*

(西南大学园艺园林学院,重庆北碚 400715)

利用重庆皱皮木瓜果渣进行总黄酮提取工艺优化研究。在单因素实验的基础上,考察乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比、提取方法等因素对皱皮木瓜果渣中总黄酮提取效果的影响,并结合正交实验优选出最佳提取条件。影响皱皮木瓜果渣总黄酮提取的因素大小顺序为:提取温度>乙醇浓度>提取时间>料液比,其中温度对总黄酮得率影响较明显。最佳提取工艺:浓度50%乙醇为提取溶剂,提取温度60℃,料液比1∶30(g·mL-1),提取时间80min；在最佳工艺条件下,皱皮木瓜果渣中总黄酮得率约为0.527%。本实验确定的优化工艺简便准确易行。

皱皮木瓜果渣,总黄酮,提取工艺

皱皮木瓜(ChaenomelesSpeciosa)又名贴梗海棠,属蔷薇科(Rosaceae)木瓜属(Chaenomeles)植物,为多年生落叶灌木,主产湖北、四川、山东、安徽、浙江等省区[1-2]。皱皮木瓜中含有丰富的营养物质,主要包括苹果酸、酒石酸、抗坏血酸、齐墩果酸以及黄酮类化合物、鞣质、纤维素等化学成分[3]。其中黄酮类化合物又称总黄酮,是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物,现在则泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物,总黄酮一般不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂。近年来发现皱皮木瓜中含有的总黄酮作用广泛,在相关报道[4-5]中提及到它的食用性,它具有显著地抗氧化及抗自由基、降压调血脂、抗癌防癌、抑菌、消炎、镇痛和松弛胃肠平滑肌等功能[6-7]。我国木瓜种类繁多,资源丰富,发掘并利用皱皮木瓜生物资源活性物质很有研究价值。

目前对总黄酮提取工艺已有相关研究[8-10],对不同种的木瓜材料,总黄酮的含量在6.66～40.839mg/g,得率在0.45%～1.348%[2,5,7],而皱皮木瓜也因不同品种间差异总黄酮含量跨度大,但一般在8.42mg/g以上[4]。本实验考虑安全、环保等因素，选择乙醇作为皱皮木瓜总黄酮的提取溶剂[11],利用皱皮木瓜果渣进行总黄酮提取工艺优化研究,延长深加工链,提高皱皮木瓜鲜果附加值,现未见相关报道,为后续研究提供参考。因此为进一步探索皱皮木瓜果渣中总黄酮物质提取的方法,确定各提取条件的适宜水平,利用对照品建立一元线性回归方程、回归直线,并采用单因素实验与正交实验方法进行结合,对皱皮木瓜果渣中总黄酮的提取工艺进行优化。这为皱皮木瓜果渣中总黄酮提取提供了方法依据和理论基础,也为皱皮木瓜的开发利用开辟新的途径,提高皱皮木瓜产品的附加值,促进木瓜的产业化发展,以期为规模化生产提供有价值的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皱皮木瓜果实样品:采样于重庆市綦江县石壕镇,其原植物标本经西南大学园艺园林学院白志川教授鉴定为蔷薇科苹果亚科木瓜属皱皮木瓜(ChaenomelesSpeciosa(sweet)Nakai),成熟新鲜果实采样后洗净切片榨汁,所得榨汁后残留的果渣置于恒温鼓风干燥箱,45℃干燥至恒重备用。

乙醇、醋酸钠、冰醋酸、三氯化铝等(均为分析纯) 北京化学试剂厂；芦丁标准品(纯度≥98%,生产批号100080-200707) 购于中国食品药品检定研究院。

万分之一电子天平 瑞士 Mettler Toledo公司；Molgene 210a型超纯水机 上海摩尔科学仪器有限公司；DU730型核酸蛋白质分析仪 美国Beckman Coulter公司；TA2003A型台式离心机 上海哈菲尔分析仪器有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；JA2003A千分之一电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；ZN-04B小型粉碎机 北京兴时利和科技发展有限公司；KQ-250DB型台式数控超声波清洗机 昆山超声仪器有限公司。

1.2 总黄酮含量的测定

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 精确称取芦丁标准品68mg,用无水乙醇定容至100mL,超声得到质量浓度为0.68mg·mL-1的标准溶液。精确吸取标准溶液0,0.0078,0.0157,0.0313,0.0625,0.125,0.25mL于10mL比色管中,各加入0.1mol·L-1AlCl32.0mL,NaAc-HAc缓冲溶液(pH5.2)1.0mL,用浓度为50%乙醇溶液定容至10.0mL,摇匀放于40℃的温水浴中显色10min后,在波长406nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标,芦丁溶液的质量浓度(mg·mL-1)为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.2 皱皮木瓜果渣中总黄酮含量的测定 皱皮木瓜果渣总黄酮含量测定应用三氯化铝比色法[12-13]。精确移取皱皮木瓜果渣总黄酮提取供试液1.0mL于10mL比色管中,按照1. 2.1节方法测定吸光度以计算其中总黄酮含量。

1.2.3 总黄酮得率的计算公式 皱皮木瓜样品中总黄酮质量浓度与吸光度在一定条件下遵从朗伯-比耳定律,以芦丁为基准物,参照芦丁标准曲线方程计算总黄酮得率。

式中:Y为总黄酮得率(%)；ρ1为吸光度按照标准曲线计算出得显色溶液中黄酮质量浓度(mg·mL-1)；V1为显色时溶液的定容体积(mL)；V2为显色时移取的提取液的体积(mL)；V为提取液的总体积(mL)；m为称取样品的质量(g)。

1.3 实验设计

1.3.1 单因素实验

1.3.1.1 单因素水平设置 实验水平设置如下,乙醇浓度:45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%；料液比:1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g·mL-1；提取温度:30、40、50、60、70、80℃；提取时间:10、20、30、40、50、60、70、80min；提取方法:索式、回流、浸提、渗漉[14-16]、240W功率超声。

1.3.1.2 单因素下皱皮木瓜果渣总黄酮的提取方法 取干燥的皱皮木瓜果渣,粉碎过80目筛后准确称量1.000g,置于50mL的烧瓶中。根据实验设计水平要求按照不同提取方法进行总黄酮提取,经3000r/min离心10min得到提取上清液,对残渣沉淀再一次进行提取,合并两次上清液,即得供试液。按照1.2.1节方法,准确称量干燥粉碎的皱皮木瓜果渣1.000g,置于50mL的烧瓶中进行总黄酮提取,每个实验3次重复,并按1.2.3节中总黄酮测定方法测定吸光度,参照芦丁标准曲线方程及公式,计算总黄酮得率。

索式提取法:精密称取木瓜果渣粉末1.000g,加入50mL 50%乙醇索式提取2h,滤过,用50%定容乙醇于50mL容量瓶中；超声提取法:精密称取木瓜果渣粉末1.000g,加入50%乙醇50mL超声提取2h,过滤残渣再加入50%乙醇50mL超声提取2h,合并两次滤液,定容于100mL的容量瓶中；回流提取法:精密称取木瓜果渣粉末1.000g用50mL 50%乙醇回流2h,最后定容到50mL的容量瓶中；浸提提取:精密称取木瓜果渣粉末1.000g用50mL 50%乙醇进行浸提2h,最后定容到50mL的容量瓶中；渗漉提取:精密称取木瓜果渣粉末1.000g用50mL50%乙醇进行渗漉2h,最后用50%定容乙醇于50mL容量瓶中。

一直以来，无论是市场营销学理论界还是教科书，都把市场营销分为传统和现代两大观念，作为市场营销学的经典理论被广泛应用。

1.3.2 正交实验 依据单因素实验,由于实际操作中总黄酮提取受乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)和提取温度(D)四个因素交叉影响,为优化皱皮木瓜果渣中总黄酮的提取工艺,考察各因素对总提取效果的影响并确定最优工艺条件,我们选用四因素、三水平进行正交实验(表1)。影响皱皮木瓜皮渣中总黄酮得率的主要因素作为考察因素进行正交实验,以总黄酮得率(Y)为实验指标,每个实验号重复2次,各实验处理见表2。

表1 正交实验因素和水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

根据芦丁标准品质量浓度与吸光度A的关系,得到线性曲线,如图1所示。芦丁标准品回归方程Y=44.608X+0.0218,R2=0.9979,表明当溶液质量浓度在0～0.017mg·mL-1范围内,溶液质量浓度与吸光度呈良好线性关系。皱皮木瓜果渣中总黄酮A为0.004,通过回归方程计算得到皱皮木瓜中总黄酮的浓度约为0.217mg·mL-1,总黄酮含量为8.68mg/g。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取的影响 在料液比1∶30、提取温度60℃、提取时间80min、240W功率超声提取两次条件下,考察浓乙醇浓度对皱皮木瓜果渣中总黄酮得率的影响,结果如图2所示。由图2可知,皱皮木瓜总黄酮得率随着乙醇浓度在45%～50%范围内增加而升高,在50%～80%范围内增加而降低,在浓度45%～55%有最大值。因此,选定45%、50%、55%是乙醇浓度对总黄酮得率较敏感的3个水平。

图2 乙醇浓度对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.2.2 料液比对总黄酮提取的影响 浓度50%乙醇为提取剂、提取温度60℃、提取时间80min、240W功率超声提取两次条件下,考察料液比对皱皮木瓜果渣中总黄酮得率的影响。由图3可知,随着提取剂使用量增大总黄酮得率随之升高,当料液比达到1∶25后,继续增大提取剂使用量得率变化不大。从减少试剂用量和保证提取效率综合考虑,选定1∶20、1∶25、1∶30(g·mL-1)是料液比对总黄酮得率较敏感的3个水平。

图3 料液比对总黄酮得率的影响Fig. 3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

2.2.3 提取温度对总黄酮提取的影响 浓度50%乙醇为提取剂、料液比为1∶30(g·mL-1)、提取时间80min、240W功率超声提取两次,考察30、40、50、60、70、80℃不同提取温度条件对皱皮木瓜果渣中总黄酮得率的影响。如图4所示,在30～60℃的温度范围内,得率随提取温度的升高而增大；当温度高于60℃后进一步升高温度,得率反而降低。考虑提取温度影响及节约能源,选定50、60、70℃是提取温度对总黄酮得率较敏感的3个水平。

图4 提取温度对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

图5 提取时间对总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

2.2.5 提取方法对总黄酮提取的影响 分别进行索式、回流、浸提、渗漉、240W功率超声提取,考察不同提取方法对皱皮木瓜果渣中总黄酮得率的影响。由图6可知,采用5种不同方法对皱皮木瓜总黄酮进行提取,其中超声得率最高也最方便,所以采用超声提取为效果好且最简单易操作的方法。

图6 提取方法对总黄酮得率的影响Fig.6 Effect of extraction methods effects on the yield of flavonoids

2.3 实验因素对总黄酮提取率的影响

正交实验所得皱皮木瓜皮渣中总黄酮得率(Y)结果见表2。

表2 L9(43)正交实验结果和直观分析Table 2 L9(43)orthogonal experiment results and intuitive analysis

从表2,表3可以清楚直观的看出,实验的4个因素中,综合极差R大小顺序及方差分析各因素对总黄酮提取影响显著性大小,得出影响皱皮木瓜果渣总黄酮提取大小顺序是:提取温度(D)>乙醇浓度(A)>提取时间(C)>料液比(B),其中显著性分析显示,提取温度对总黄酮得率影响显著,这表明皱皮木瓜果渣总黄酮提取中温度控制需更加稳定。从表2中K值可以得出,皱皮木瓜果渣中总黄酮提取的最优组合:A2B3C3D2,即采用50%的乙醇溶液,以1∶30(g·mL-1)的料液比在60℃的水浴中240W超声80min。

表3 正交结果方差分析Table 3 Orthogonal the results of variance analysis

2.4 最优条件验证实验

取干燥的皱皮木瓜果渣,粉碎过80目筛后准确称量1.000g 3份,按最佳工艺在浓度50%的乙醇溶液,提取温度为60℃,料液比为1∶30(g·mL-1),240W功率超声提取时间80min条件下提取两次后进行总黄酮含量的测定,平行测定结果见表4。

表4 重复性实验结果(n=3)Table 4 Repetitive experimental results(n=3)

从表4可以看出,最佳工艺提取技术较稳定,测定皱皮木瓜果渣中总黄酮的平均得率为0.527%,高于正交组合的提取率,科学可行,达到实际工业生产要求。根据表4可知1.000g皱皮木瓜果渣中总黄酮提取量约为5.267mg。

2.5 最优提取条件确定

根据正交实验结果,得出4因素影响的主次为:提取时间,乙醇浓度,提取时间,料液比。通过验证实验,综合考虑经济因素,时间因素,消耗能源方面,确定最优提取条件为浓度50%的乙醇,以1∶30(g·mL-1)料液比在60℃的水浴中240W功率超声提取80min,提取次数两次。

3 结论

本文就皱皮木瓜果渣总黄酮提取工艺进行了单因素的实验探索,并结合正交实验优化提取工艺条件。结果表明:影响皱皮木瓜果渣总黄酮提取的因素大小顺序为:提取温度>乙醇浓度>提取时间>料液比,其中温度对总黄酮得率影响较明显。皱皮木瓜果渣中总黄酮提取的最优组合:A2B3C3D2,即为浓度50%乙醇为提取溶剂、提取温度60℃,料液比1∶30(g·mL-1),提取时间80min；在最优提取条件下,皱皮木瓜果渣中总黄酮得率约为0.527%。综合验证实验表明本实验采用的工艺条件操作简单,效果准确。由于本实验为初步探究,这为皱皮木瓜资源在我国的开发利用和发展提供了基础数据。但旨得到皱皮木瓜果渣中总黄酮更精确提取条件,需设计各因素水平梯度范围以研究其对总黄酮提取的影响。本研究在保健食品、疾病防治、医疗保健等领域具有广泛的应用前景,更具有理论意义和实践价值。

[1]黄泰康,丁志遵,赵守训.现代本草纲目:上卷[M].北京:中国医药科技出版社,2001:398.

[2]刘朝霞,胡士德,龚大春,等.资丘木瓜总黄酮提取工艺研究[J].安徽农业科学,2012,40(9):5145-5147.

[3]陈洪超,丁立生,彭树林,等.皱皮木瓜化学成分的研究[J].中草药,2005,36(1):30-31.

[4]于晓亮,王建华.木瓜属植物果实中有效成分含量测定[J].山东农业科学,2012,44(2):48-54.

[5]严睿文,丁毅.宣木瓜中黄酮的提取分离及含量的测定[J].生物学杂志,2008,25(3):62-64.

[6]孔劲松,杨兴海.皱皮木瓜总黄酮镇痛作用的机制分析[J].时珍国医国药,2009,20(3):549-550.

[7]周晓丽,邵震,李婷婷,等.木瓜黄酮的提取及抗氧化性生研究[J].食品工业科技,2007,28(8):170-172.

[8]雷明.桂花果类黄酮分离纯化工艺及其抗氧化研究[J].西南大学学报：自然科学版,2011,11(4):77-82.

[9]周才琼,李书文,万宇波,等.金银花花叶总黄酮类化合物的最佳提取工艺研究[J].西南大学学报：自然科学版,2003,25(3):262-264.

[10]纪学芳,徐怀德,张淑娟,等.响应面实验优化超声波提取光皮木瓜黄酮和多糖复合物[J].食品科学,2013,34(6):47-51.

[11]于修烛,王玲,杜双奎,等.响应面法优化枳椇子总黄酮超声波提取工艺[J].食品科学,2011,32(12):125-129.

[12]张琪,刘慧灵,朱瑞,等.苦荞麦中总黄酮和芦丁的含量测定方法的研究[J].食品科学,2003,24(7):113-116.

[13]杜薇,刘国文.刺梨总黄酮的含量测定及资源利用[J].食品科学,2003,24(1):112-114.

[14]张琳,张瑾. 淫羊藿总黄酮的提取方法研究[J].现代中药研究与实践,2004(18):63-64.

[15]易月能,杨华,赵勇,等.渗漉法提取广枣中黄酮类成分的工艺研究[J].中国中药杂志,2010,35(14):1806-1808.

[16]赵浩如,郜凤香.葛根总黄酮的提取法法研究[J].中成药,2000,22(11):756-758.

Study on flavonoids extraction technology fromChaenomelesSpeciosapomace of Chongqing

WEI Zheng-xin1,LIU Shi-yao2,*,BIAN Jing-jun2,CAI Juan2,PAN Xue-zhen2,ZHANG Dan2,BAI Zhi-Chuan2,*

(Southwest university Institute of Gardening,Beibei 400715,China)

To optimize the extraction process conditions for total flavonoids from theChaenomelesSpeciosapomace of Chongqing. On the basis of the single-factor test,effects of solid-liquid atio,ethanol concentration,extraction time,extraction temperature and extraction times on the extraction rate were studied by taking the content of total flavonoids as the index. The influence degree of four factors on the extraction rate of total flavonoids was in the order of extraction temperature>ethanol concentration>extraction time>solid-liquid ratio.Among them,temperature had relatively significant impacts on the yield rate of total flavonoids fromChaenomelesSpeciosapomace. The best extraction technology:concentration of 50% ethanol as xtraction solvent,60℃ extraction temperature,1∶30(g·mL-1)solid-liquid ratio,80min extracting time. Under this condition,the yield was 0.527%. This method was simple convenient and accurate for the detection of total flavonoids.

ChaenomelesSpeciosapomace;flavonoid;extraction technology

2014-05-19

韦正鑫(1990-)，女，硕士，研究方向：植物化学。

*通讯作者:白志川(1956-)，女，博士，教授，研究方向：药用植物。 刘世尧(1979-)，男，硕士，副教授，研究方向：植物资源学与中药材质量控制方向。

重庆科技攻关计划项目( CSTC，2009AC1180)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)03-0242-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.042