邓 红,赵茜茜,夏秋敏,高 丹,孟永宏,郭玉蓉

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

榨前分离苹果清汁中多酚的提取与分析

邓 红,赵茜茜,夏秋敏,高 丹,孟永宏,郭玉蓉

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

以榨前分离苹果清汁为样品,优化其多酚的提取和分析方法,与传统工艺下清汁中的多酚进行比较,以明确榨前分离工艺的优势。实验采用超声波辅助提取法优化了多酚提取条件,并优化了苹果清汁多酚的HPLC分析方法。结果表明,提取多酚的最优参数为温度50℃,时间40min,果汁与提取剂之比1∶3；优化多酚的HPLC检测条件为检测波长280nm,流动相甲醇-0.3%冰乙酸水溶液,实验确定的梯度洗脱程序下多酚的分离效果较好。结论是两种工艺下其苹果清汁多酚物质种类无显著差异,但榨前分离苹果汁中多酚的含量比传统工艺果汁减少了23.62%,可以有效降低苹果汁褐变的发生。

榨前分离,苹果清汁,多酚,提取,分析

植物多酚是存在于植物组织中的次生代谢产物,具有良好的抗氧化活性和自由基清除能力。研究表明:酚类化合物在预防癌症、心脏病、呼吸系统疾病,和促进体内排毒等方面具有明显效果[1-2]。

苹果多酚是苹果中所含酚类物质的统称,主要分布在苹果的果皮和果芯中,是果汁中重要的风味和呈色物质[3-4]。苹果多酚的种类繁多,可分为黄烷醇类,如儿茶素、表儿茶素；黄酮醇类,如槲皮素、芦丁；羟基肉桂酸类,如咖啡酸、绿原酸；二氢查耳酮类,如根皮素、根皮苷等[5-6]。苹果多酚是引起果汁褐变的主要原因之一,所以对苹果多酚的检测和控制对苹果汁加工企业尤为重要。苹果多酚的检测目前常用的有Folin-Ciocalteu(FC)法、正丁醇-盐酸水解法、香兰素法、Folin-Denis(FD)法、HPLC法、UV法等[7-8]。采用HPLC法测定单酚在整个样品中的含量在国内外已有报道,但样品前处理中需要进行多酚的提取和纯化,步骤比较繁琐,本实验的榨前分离新工艺可简化前处理又能使多酚比较容易从样品中提取出来。

榨前分离是一种运用冷破碎设备能够在榨汁前同时将苹果皮、果柄、果籽、果核、木质素及果肉进行分离,把影响苹果汁风味的大多数物质与榨汁用果肉隔离开来,极大地提高苹果汁的品质的新工艺[9-11],而苹果加工工艺的革新更是帮助中国浓缩苹果汁企业走出困境的重要举措。

传统工艺清汁是整果破碎,果皮、果柄、果籽、果核、果肉全部在一起压榨制汁,成分比较复杂；榨前分离苹果清汁仅用苹果果肉榨汁,成分较简单。本文以榨前分离苹果清汁为样品,以传统工艺清汁为对照,采用液液萃取来提取样品有机相中的多酚物质,进行工艺条件优化；采用HPLC法分析多酚,并优化HPLC检测条件,同时与传统工艺苹果清汁中多酚物质的差异进行对比,以期为苹果多酚的开发利用和果汁加工行业工艺技术的改进提供基础资料和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验用红富士苹果 采于陕西省咸阳市长武县果园,装于塑料袋置冷库中(0±1℃)贮藏,待用。标准品(没食子酸、绿原酸、咖啡酸、4-羟基苯甲酸、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、根皮素、原花青素B1、原花青素B2、金丝桃苷、根皮苷、槲皮苷、异槲皮苷、芦丁) 均购于Sigma公司；分析试剂(色谱纯甲醇、分析纯乙酸乙酯和冰乙酸) 购于西安森博化玻仪器供应站。

DIONEX P680型戴安高效液相色谱仪 美国戴安公司；迪马C18液相色谱柱(4.6×250mm,5μm) 迪马科技有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；KQ-200KDE型高功率数显超声波清洗器 昆山市超生仪器有限公司；JA2003型电子天平 上海精科天平有限公司；722型紫外可见分光光度计 上海市光谱仪器有限公司；冷破碎设备 陕西师范大学食品学院与西安鼎合机械公司共同研制。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 苹果→拣选→清洗→破碎(传统工艺与榨前分离工艺)→酶解 →榨汁 →过滤→苹果汁相关质量指标(多酚等)分析。

按此流程制得两组样品,分别是榨前分离工艺苹果清汁和传统工艺苹果清汁；所有果汁样品均稀释至11.5°Brix进行指标分析。

1.2.2 苹果多酚的提取

1.2.2.1 有机溶剂的选择 在料液比和温度相同的条件下,取10mL果汁样品,用甲醇、乙醇、乙酸乙酯三种溶剂各200mL对果汁中的多酚类物质进行液液萃取以提取多酚,考察这三种溶剂提取多酚的效果,选出提取效果较好的溶剂进行后续实验。

1.2.2.2 提取方法的选择 a.热回流提取法:量取20mL果汁于三口烧瓶中,量取100mL乙酸乙酯倒入提取瓶,用电热套加热,温度设为60℃,回流提取2h,测定乙酸乙酯溶液中总酚的含量。b.溶剂萃取法:用量筒量取20mL果汁于烧杯中,加入100mL乙酸乙酯,在50℃水浴中不停搅拌20min,取出,倒入分液漏斗中,静置分层,取上清液并测定多酚含量。c.超声波辅助提取法:量取20mL果汁于烧杯中,加入100mL乙酸乙酯,在温度为50℃,功率为70W的条件下超声20min,然后静置分层,取上清液并测定多酚含量。

1.2.2.3 超声波辅助提取多酚的工艺 a.超声提取时间对提取效果的影响:固定提取温度为50℃,料液比为1∶5,超声功率为70W,设计超声时间分别为10、20、30、40、50、60min,考察超声时间对多酚提取效果的影响。b.温度对提取效果的影响:固定果汁与提取剂之比为1∶5,超声功率为70W,提取时间依上述实验确定,分别在30、40、50、60、70℃条件下进行超声提取,考察超声温度对超声效果的影响。c. 果汁与提取剂之比对提取效果的影响:超声时间、温度均由上述实验确定,果汁与提取剂之比分别在1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的条件下进行提取,考察果汁与提取剂之比对多酚提取效果的影响。

1.2.3 酚类物质的定性和定量分析 在已确定的色谱条件下,对15种单酚的标准溶液进行测定,确定标准物质的保留时间,再对混合标样进行测定,以保留时间对样品中的多酚物质定性。

根据样品浓度和峰面积之间的正比关系,在已确定的色谱条件下,对15种单酚的标准溶液进行测定,记录标准物质的峰面积,再对混合标样进行测定,以峰面积对样品中的多酚物质进行定量分析。

1.2.3.1 样品溶液的制备 取20mL果汁样品,加入一定量的有机溶剂,通过上述优化的多酚提取方式,将多酚物质从果汁中萃取到有机溶剂,得到其有机溶液,再通过真空旋转蒸发仪将有机溶剂蒸发掉,使多酚物质析出,再用氮气吹干,以甲醇定容至5mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,待液相色谱分析。

1.2.3.2 标准溶液的配制 称取一定量的没食子酸、绿原酸、咖啡酸、4-羟基苯甲酸、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、根皮素、原花青素B1、原花青素B2、金丝桃苷、根皮苷、槲皮苷、异槲皮苷、芦丁标准品,溶于70%甲醇溶液中,定容至10mL棕色容量瓶中,摇匀,放入冰箱4℃避光贮存备用。再取一定体积的各个单标配成系列混合标准溶液。

1.2.3.3 色谱条件的确定 根据多酚物质的特性,选择色谱柱为Discovery C18,150mm×4.6mm,5μm；查阅相关文献[12-14]可知,柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；其他色谱条件有待实验确定,主要如下:

a.确定检测器波长:对样品进行紫外区全波长扫描,选择测定酚类物质的最佳波长；b.流动相选择:流动相有甲醇-0.1%醋酸水溶液,甲醇-0.1%磷酸水溶液,根据出峰效果选择最佳流动相。c.梯度洗脱程序的调试:以甲醇-0.1%醋酸水溶液为流动相分离果汁中的多酚,通过改变流动相的比例以及浓度梯度来达到分离各峰的目的。

1.2.4 方法学验证

1.2.4.1 回收率的考察 将一定量的各单酚标准品加到样品果汁中,按照文献方法[15-17]进行前处理,在已确定的色谱条件下进行 HPLC 测定,计算各组分的加标回收率。

加标回收率(%)=(实测值(mg)-样品中含量(mg))/添加值(mg)×100

式(1)

1.2.4.2 精密度实验 取供试品样品溶液,等量重复进样5次,按上述最佳色谱条件进行分析,计算这5次中各组分含量的RSD(相对标准偏差)。若RSD均小于3%,则表明仪器精密度良好。计算公式为:

式(2)

1.2.4.3 稳定性实验 取供试品样品溶液,分别于配置后0、4、8、16、24h进样,按优化的色谱条件进行分析,计算这5次各组分含量的RSD。

1.3 数据统计分析

采用DPPS软件对实验数据进行统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 苹果多酚的提取工艺

2.1.1 有机溶剂的选择 实验测定的榨前分离苹果汁多酚含量如图1所示。

图1 不同溶剂对果汁样品中多酚提取的影响Fig.1 Influence of different solvent for extracting polyphenols in the juice sample

图1对比了三种溶剂萃取多酚的效果,可以看出甲醇对果汁中多酚的提取量高于乙醇和乙酸乙酯,提取能力的顺序为甲醇>乙酸乙酯>乙醇,但是实验中发现用甲醇和乙醇提取果汁中的多酚时,虽多酚进入醇相,但果汁中会产生白色沉淀,原因是果汁中的糖类物质不溶于甲醇和乙醇,而采用乙酸乙酯进行提取时,由于乙酸乙酯不溶于水,不会造成果汁浑浊,而此时多酚物质会从果汁中被萃取到乙酸乙酯中,只要对上清液进行旋转蒸发,乙酸乙酯蒸发后多酚物质自然析出,这样就简化了提取工艺,因此,采用乙酸乙酯作为提取溶剂进行后续实验。

2.1.2 提取方法的选择 采用三种提取方式提取多酚的结果如图2所示,可以看出超声波辅助提取的效果是最好的,溶剂萃取法次之,热回流提取的效果最差。热回流提取耗时长,对多酚的影响较大,而超声波辅助提取的时间短、效率高,因此,采用超声波辅助提取方法。

图2 提取方法对多酚提取效果的影响Fig.2 Influence of different method for extracting polyphenols in the juice sample

2.1.3 超声波辅助提取多酚工艺

2.1.3.1 提取时间对多酚提取效果的影响 实验结果见图3,图3表明液液萃取时随着超声提取时间的延长,果汁中的多酚不断溶出进入醇相中,提取量不断上升；在40min后,超声波辅助下的提取基本达到动态平衡,增长趋于缓慢,因此,确定40min为最佳提取时间。

图3 提取时间对多酚提取效果的影响Fig.3 Influence of different time for extracting polyphenols in the juice sample

2.1.3.2 提取温度对多酚提取效果的影响 实验结果见图4,从图4可以看出,随着温度的升高,分子运动速度加快,多酚的提取量不断增大,温度高于50℃后,多酚的提取量增长缓慢。因为在温度较高的情况下,乙酸乙酯挥发更快,溶剂的减少则提取量降低；从能源方面考虑,温度的升高会造成热能浪费,因此确定50℃为提取最佳温度。

图4 提取温度对多酚提取效果的影响Fig.4 Influence of different temperature for extracting polyphenols in the juice sample

2.1.3.3 果汁与提取剂之比对多酚提取效果的影响 实验结果见图5,可以看出,果汁与提取剂之比对提取效果的影响不显著,因为每种提取剂对于多酚的溶解度有限。从曲线的趋势看,在果汁与提取剂之比为1∶3时,提取的效果较好,果汁与提取剂之比大于1∶3后的提取量增大不明显,考虑经济高效方面,选择果汁与提取剂之比1∶3为最佳。

2.2 苹果多酚的检测分析

2.2.1 色谱条件的优化

2.2.1.1 检测器波长的确定 果汁经过乙酸乙酯超声波辅助提取,将多酚物质萃取到乙酸乙酯中,通过对乙酸乙酯提取液进行紫外全波长扫描,结果如图6所示。

图6 样品全波长扫描图Fig.6 Wavelength scan of apple juice Sample

可以看出,样品在217nm和290nm处有吸收峰,查阅文献得知,217nm处多为糖酸类物质,而多酚集中吸收波长在280nm左右,通过对比260、270、280、290nm下色谱分离多酚的效果,选择280nm作为检测波长。

2.2.1.2 流动相的选择 多酚类物质的酚羟基、羧基在水溶液中容易发生电离,使得极性增强,容易在色谱柱固定相表面形成双重保留,色谱峰拖尾严重,因此定量分析误差较大。如果在流动相中加入少量酸性调节溶液,如冰乙酸溶液,可使多酚的电离受到抑制,极性减弱,使分离效果和峰形得到改善。实验比较了流动相甲酸-水、甲醇-0.1%冰乙酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液,通过色谱图看出加入酸溶液的流动相体系明显改善了分离效果和峰形,加入冰乙酸的效果比磷酸好。因此以流动相为甲醇-0.1%冰乙酸水溶液,甲醇-0.3%冰乙酸水溶液,甲醇-0.5%冰乙酸水溶液进行实验,发现甲醇-0.3%冰乙酸水溶液的的流动相体系最好,最终选择流动相为甲醇-0.3%冰乙酸水溶液。

2.2.1.3 梯度洗脱程序的优化 以上述条件对样品进行色谱分析,不断调节梯度程序,最终确定以下梯度程序如图7所示。

图7 HPLC梯度洗脱程序图Fig.7 Diagram of HPLC gradient elution program

2.2.2 苹果汁有机相中多酚的液相色谱分析 在果汁的加工工艺工程中,杀菌和酶解这两步对果汁中酚类影响较大,均会减少酚类物质的含量,并且促进酚类物质聚合反应的发生。研究酚类物质对于考察加工工艺有一定意义。

2.2.2.1 多酚标准品的分离结果 实验结果见图8,根据单酚的出峰时间,图8中按出峰的先后顺序对单酚进行排列,与序号的对应关系为:1-没食子酸、2-原花青素B1、3-儿茶素、4-4-羟基苯甲酸、5-原花青素B2、6-绿原酸、7-咖啡酸、8-表儿茶素、9-槲皮素、10-金丝桃苷、11-芦丁、12-异槲皮苷、13-根皮苷、14-槲皮苷、15-根皮素。

图8 15种多酚混标的分离效果Fig.8 Separation effects of 15 polyphenols mixed standard

2.2.2.2 榨前分离工艺和传统工艺下苹果汁样品多酚分离结果 采用液相色谱分析,实验结果见图9和图10。对比图9和图10两图可以看出,榨前分离果汁谱图中出峰少,且峰高低于传统工艺谱图中的各峰,这说明了榨前分离工艺中的多酚在种类和数量上均较少。另外,两种果汁中均含有许多未知的物质,由于标品的局限性,未能对其进行定性和定量分析,还有待进一步研究和分析。

图9 榨前分离果汁有机相中多酚的分离效果Fig.9 Separation effects of polyphenols in apple juice produced by pressing pre-peeled apple

表1 榨前分离与传统工艺果汁中多酚物质的测定结果Table 1 Results of the phenolic compound in apple juice produced by different technology

图10 传统工艺果汁有机相中多酚的分离效果Fig.10 Separation effects of polyphenols in apple juice produced by traditional technology

注:-表示未检测出。根据多酚物质的保留时间排序,记录峰面积大小,对果汁中的酚类物质进行定性和定量分析,结果列入表1。

如表1所示,两种果汁均鉴定了14种多酚物质,这些多酚在果汁中含量较多的有绿原酸、表儿茶素、根皮苷、原花青素B2、儿茶素,其他单酚含量较少,且均不含咖啡酸；从含量上看,14种多酚在传统工艺果汁中含量为164.96μg/mL,在榨前分离果汁中的含量为126.0μg/mL,后者比前者少了23.62%；从减少量分析,单酚含量减少量较大的有原花青素B2、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮素,而这几种单酚多分布在苹果的果皮、果梗中,因此榨前分离工艺对这几种单酚的损失较多。

2.2.3 方法学验证结果 如表2所示,各酚的加标回收率均在85%以上,说明该分离方准确可靠；精密度实验的RSD 为0.6%～2.1%,小于3%,说明该方法的精密度合格；但是,稳定性实验的RSD均较大,这说明了多酚类物质在果汁中的含量不稳定,随着时间在不断变化,主要是因为酚类物质易受加工工艺和储存时间影响[18]。因此,本方法用于同时测定苹果清汁中多种酚类物质的含量,具有较高的灵敏度和精密度,可行性强。

3 结论

3.1 以乙酸乙酯作为有机提取溶剂,采用超声波辅助方法提取多酚,单因素实验确定的提取条件为:提取温度50℃,时间40min,料液比1∶3。

3.2 确定HPLC检测多酚的优化方法为:检测波长为280nm,流动相为甲醇-0.3%冰乙酸水溶液,梯度洗脱条件下多酚的分离效果较好。

表2 方法学验证实验的测定结果Table 2 Results of methodological validating test

3.3 应用优化的提取方法和HPLC检测条件,在两种工艺下的果汁中均检测出了14种多酚,则榨前分离苹果清汁与传统工艺苹果清汁中多酚物质在种类上无显著差异；从15种单酚的分布情况看,绿原酸的含量最多,较高的是表儿茶素、根皮苷、原花青素B2、儿茶素,其他的单酚含量均较少；从含量上,榨前分离果汁中的含量比传统工艺果汁减少了23.62%,这对于减小果汁的褐变有良好作用。

3.4 经过方法学验证实验,说明本方法适用于测定苹果清汁中酚类物质的含量,比传统分析方法操作简单,且具有较高的灵敏度和精密度,可行性强。

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Analysis and extraction for polyphenols in apple juiceof pre-pressing fruit

DENG Hong,ZHAO Xi-xi,XIA Qiu-min,GAO Dan,MENG Yong-hong,GUO Yu-rong

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China)

Using the apple juice of pre-pressing fruit as testing sample,the extracted and analyzed method of polyphenols in juice was optimized. The difference of polyphenols content between juice pressed pre-peeled and traditional process that pressed whole fruit was compared to show the advantages of pre-pressing fruit. The extracting condition of polyphenol was optimized using ultrasonic assisted extraction method and the method of polyphenols detection by HPLC also was optimized. The results showed that optimal extracting condition of polyphenol was temperature 50℃,time 40min,ratio of juice to extracting 1∶3 and detection wavelength of HPLC was 280nm,linear gradient elution compose of methanol and 0.3% acetate acid solution. The polyphenols separated result was best under the gradient elution condition which was determined in this test. So the polyphenol content in juice pre-pressing was decreased 23.62% as the category was same between traditional process and juice pressed pre-peeled method. The browning of the apple juice can effectively reduce in the new processing.

pre-pressing fruit;apple juice;polyphenol；extraction;analysis

2014-04-18

邓红(1967-)，女，博士，副教授，研究方向：食品工程。

中央高校科研业务专项经费项目(GK261001330)；农业部苹果体系(CARS-28)项目资助。

TS255.44

B

1002-0306(2015)03-0214-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.036