范芳芳，孙慧莹，徐晖，刘佳玮，张海员，李亦兰，宁雪莲，孙悦，白静，傅松滨，周春水



重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

范芳芳，孙慧莹，徐晖，刘佳玮，张海员，李亦兰，宁雪莲，孙悦，白静，傅松滨，周春水

哈尔滨医科大学医学遗传学教研室，黑龙江哈尔滨 150081

范芳芳, 孙慧莹, 徐晖, 等. 重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定. 生物工程学报, 2015, 31(12): 1753–1763.Fan FF, Sun HY, Xu H, et al. Expression, purification of recombinant cationic peptide AIK in Escherichia coli and its antitumor activity. Chin J Biotech, 2015, 31(12): 1753–1763.

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系，建立表达及纯化重组AIK的最优条件，为深入研究和利用AIK奠定基础。首先，设计含AttB重组位点的引物，通过重叠PCR技术扩增出AttB-TEV-FLAG-AIK序列，利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中，构建入门载体，再通过LR重组反应，将目的序列转移到目的载体pDEST15中，构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后，在BL21 (DE3) 工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白，再以rTEV酶切除GST，获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21 (DE3) 工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37 ℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(600=1.0) 4 h，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30% 以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之，本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒，实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达，经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽，为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。……