乔支红,李艳芳,许荣华,姜 慧,张 琦,修 宇

(1.北京联合大学旅游学院,北京 100101;2.北京市食品及酿酒产品质量监督检验一站,北京 100075)

豆腐酸浆老汤中产酸菌的分离筛选与鉴定

乔支红1,李艳芳2,许荣华1,姜 慧1,张 琦1,修 宇1

(1.北京联合大学旅游学院,北京 100101;2.北京市食品及酿酒产品质量监督检验一站,北京 100075)

利用MRS选择性培养基,从分别采自山东邹平、陕西榆林、河北涞源、云南石屏、云南建水及云南元阳的6份酸浆老汤中分离纯化出12种菌落形态不一样的乳酸菌,分别采用MC改良培养基和发酵黄浆水pH及产酸量的监测对12种菌进行初筛及复筛,筛选出一株产酸较快、较高的乳酸菌,并对该菌株进行了菌落形态、生理生化及16S rDNA序列分析的鉴定实验,结果表明:该菌株为革兰氏阳性菌,菌落特征为白色,圆形,表面突起,不透明,边缘整齐,镜检发现该菌为球菌、直径为0.8μm,四联或成串排列,经生理生化及16S rDNA序列鉴定确定该菌为肠球菌属中的屎肠球菌(Enterococcusfaecium),遗传稳定性较好。

豆腐酸浆老汤,分离,鉴定,屎肠球菌

酸浆豆腐为我国民间传统的一种豆腐制品,有上百年的历史,它是以酸浆为凝固剂制作而成。其味道独特,弹性较好,是农家乐豆腐宴中的极品,深得旅游者的喜爱[1]。在民间酸浆豆腐制作的调研中发现,酸浆豆腐的制作多为手工作坊,工业化生产的厂家几乎没有,其根本原因在于酸浆无法标准化生产,进而制约了酸浆豆腐的工业化生产。

农民制作豆腐所用的酸浆,是用酸浆老汤为“酵种”,再加入新的黄浆水放置一晚后酸化而成。如不加入酸浆老汤,其酸化速度较慢。而且发现,不同地方所制作的酸浆颜色、风味有所不同,酸浆豆腐的口感也略有不同。可见,老汤对于酸浆及酸浆豆腐的制作及风味有较大的影响。酸浆老汤为自然发酵而成,微生物种类繁多,不同的地理环境决定了老汤中优势菌群的种类,优势菌也较固定,进而影响酸浆及酸浆豆腐的质量。可以说,酸浆老汤中的优势微生物是制作酸浆及酸浆豆腐的关键所在。若从酸浆老汤中将使酸浆变酸的主要微生物分离筛选出,纯种发酵酸浆,即可将酸浆量化进行大规模的标准化生产,进而可完成酸浆豆腐的标准化生产,为我国民间酸浆豆腐的工业化生产提供有力的前提保证。目前,国内有关豆腐酸浆中微生物的筛选研究也有,然而,多数筛选的实验材料为自制的黄浆水酸化后或点浆所用的酸浆[2-4],其微生物受环境影响较大。

本研究以采集的中国六个不同地方的酸浆老汤为试样,分析不同地方酸浆老汤中乳酸菌的分布情况,利用乳酸菌选择性培养基从中分离筛选产酸较多、遗传稳定性较好的优势乳酸菌种,并进行鉴定,为酸浆的标准化生产提供一株较好的生产菌种。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

黄浆水 北京道尔泰豆腐店提供；酸浆老汤 采自山东邹平、河北涞源、陕西榆林、云南建水、云南石屏、云南元阳；培养基:黄浆水液体培养基(自制:黄浆水+2%葡萄糖121℃高压灭菌)；MRS固体、液体培养基；改良MC固体培养基 北京蓝弋化工产品有限责任公司；API 20 STREP乳酸菌生化鉴定试剂盒 梅里埃(中国)有限公司。

PHS-25酸度计 上海精密科学仪器公司；DHP-420BS电热恒温培养箱 天津市中环实验电炉公司；ZDX-35BI(30L)灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SL602N电子天秤 上海民桥精密仪器公司；超声波振荡器,DH-101-OBS电热鼓风干燥箱 天津市中环实验电炉公司；SW-CJ-2FD超净台 上海博迅实业有限公司；YS100摄影生物显微镜 南京江南光电股份公司。

1.2 实验方法

1.2.1 增殖培养 取5mL酸浆老汤接种于20mL灭菌黄浆水液体培养基内,放入37℃恒温培养箱静置培养48h。

1.2.2 稀释涂布 用灭菌生理盐水将增殖培养后的菌液以十倍稀释法稀释到10-5、10-6、10-7三个稀释度,每个稀释度取菌液100μL,采用涂布平板法,分别涂布于MRS、改良MC两种固体培养基上,涂布好的平板倒置放入37℃恒温培养箱培养48h。

1.2.3 乳酸菌的分离纯化 取出培养好的MRS培养基平板,在超净台上观察。其中,MRS培养基中挑取菌落特征不同的菌种,并对不同菌落特征的菌计数,挑取单菌落在灭菌后MRS固体培养基上划线分离2～3次,直至纯菌并编号,分别于10倍放大镜下进行菌落形态学观察,挑取单菌落进行革兰氏染色,于100倍光学显微镜下进行菌体形态观察,并记录。选取革兰氏染色阳性菌接种于MRS斜面,于37℃恒温培养箱培养48h后4℃保存,备用。

1.2.4 产酸菌种的初步筛选 分别将分离纯化的12株革兰氏阳性菌接种于MRS液体培养基中,于37℃恒温培养箱静置培养48h后,稀释适当的稀释度后涂布于改良MC培养基[5]中,于37℃恒温培养箱培养48h,观察是否有溶钙圈,如有溶钙圈初步判定为产酸菌株。于MRS斜面培养后4℃保存,备用。

1.2.5 产酸菌种的复筛 乳酸量的测定:将初步筛选出的具有溶钙圈的5种纯种菌株接入MRS液体培养基,恒温培养24h后,用无菌生理盐水以10倍稀释法稀释到10-6,涂布于MRS固体培养基上,并于37℃恒温培养箱中培养24h,进行菌落计数。取含相同菌数的不同菌液分别接进装有20mL灭菌新鲜黄浆水的试管中,每种菌接7支试管,于37℃的培养箱中静置培养。分别在2、4、6、8、10、12、24h时取出一支试管测定试管内培养液的乳酸量。

乳酸含量测定用总酸测定方法[6],用标定后的NaOH溶液(约0.08mol/L)进行滴定测量,公式如下:

产酸量(以乳酸计)=c×(v1-v0)×k×F/v×100

式中:C-NaOH标准溶液的浓度,mol/L(约0.08mol/L)；V1-NaOH标准溶液在滴定待测样时所消耗的体积,mL；V0-滴定黄浆水原样消耗的标准NaOH,mL(约0.3mL)；V-待测样的体积,mL；F-样品稀释倍数；K-换算为主要酸的系数,即1molNaOH相当于乳酸的克数,用乳酸计K=0.09。

黄浆水发酵液pH的测定:采用酸度计测定。

根据不同发酵时间下,菌种产酸能力的测定,筛选出产乳酸量高,发酵液pH下降快的菌株。

1.2.6 产酸菌的生理生化鉴定 根据《伯杰细菌鉴定手册》[7]《常见细菌系统鉴定手册》[8]中乳酸菌的生化鉴定实验方法,利用API 20 STREP生化反应鉴定系统对复筛出的菌株进行生理生化特性实验。

1.2.7 产酸菌的16S rDNA序列分析鉴定 将待检菌株送于中国微生物菌种保藏管理中心进行16S rDNA序列测定,运用Clust X软件校准排齐后,在GenBank 数据库中进行BLAST同源性比对分析。以16S rDNA的序列同源性大于99%为标准进行属种归类。然后再对待测菌株与模式菌株16S rDNA序列利用MEGA 5.0软件构建系统发育树,进一步进行种属鉴定。

1.2.8 遗传稳定性的定性实验 将待测菌株分别在液体培养基中传代10次,取空白10mL,样液10mL,用经过约0.01mol/L的邻苯二甲酸氢钾标准溶液标定的0.1 mol/L NaOH滴定,测定每一代的产酸情况,方法同1.2.5。判断其遗传性能的稳定性。

1.3 数据处理

数据折线图采用Excel2007制作,数据统计采用SPSS 19.0进行ANOVA单因素方差分析及Ducan’s多重检验(p<0.05),数值以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 分离出的12种不同菌种的菌落特征及菌体形态描述

经多次分离纯化,从六个不同地方的酸浆老汤中获得共12株菌落形态特征不一样的菌种,通过革兰氏染色实验,12株菌均为革兰氏阳性菌。利用显微镜观察菌株的菌体形态特征,均与乳酸菌相符。结果如表1所示。

表1 12种乳酸菌菌落特征及菌体形态描述结果Table 1 The description of colony characteristics and mycelia morphology of 12 strains

2.2 六个不同地方酸浆老汤中乳酸菌的分布情况

对不同地区酸浆老汤中的不同菌种进行菌落计数,并进行统计分析,如图1所示。

图1 不同地方乳酸菌种分布情况Fig.1 The distribution of lactic acid bacterium in the different samples

自然环境对微生物的种类有较大的影响。从图中,可以看到不同地方,由于自然环境不同,酸浆老汤中分布的乳酸菌种也有所不同,平均每个老汤样品中有3～4种不同的乳酸菌；另外,也可以看到,同一菌种在不同地方中均有出现,如10号菌种在山东邹平、云南建水、云南石屏及陕西榆林四个地方的酸浆老汤中均有分布,且该菌为优势菌,说明该菌种具有发酵酸浆的共性。

2.3 产酸菌种的初筛结果

根据方法1.2.4对12株乳酸菌进行溶钙圈实验,由于改良的MC培养基中添加了CaCO3,所以随着乳酸菌的生长,乳酸菌产生的酸会溶解培养基中的CaCO3,在菌落周围形成透明圈。如图2所示:

图2 菌株溶钙圈示意图Fig.2 The soluble calcium circle

选取有溶钙圈的菌株进入复筛,有溶钙圈的菌株为3号、7号、9号、10号及11号菌。

2.4 产酸菌种的复筛结果

为比较各菌株的产酸能力,分析了3号、7号、9号、10号及11号乳酸菌在黄浆水发酵过程中产乳酸量及发酵液pH的变化,结果如图3、图4所示。

图3 24h内发酵液乳酸量的变化Fig.3 Lactic acid production of fermented tofu whey in 24h

图4 24h内发酵液pH的变化Fig.4 The pH values of fermented tofu whey

黄浆水中含有蛋白质、糖及微量矿物质、维生素等丰富的营养物质[9-10],乳酸菌可很好的生长繁殖。从图3中可以看出,乳酸菌利用黄浆水中的糖发酵产生乳酸,随时间的延长而呈上升的趋势,相应的发酵液的pH呈逐渐下降的趋势(如图4所示)。不同乳酸菌在黄浆水中的生长速度不同,所产生的乳酸量的多少及发酵液pH下降速度有所不同,从图3、图4中可以看出,在同一发酵时间里,10号菌产生的乳酸量较其它菌种多,相应的发酵液的pH也较低,随时间的延长,pH下降速度较快,直到发酵12h时,发酵液的pH达到3.51,发酵24h时达到3.26。六个地方所采集的酸浆老汤,pH平均为3.53,可见,10号菌具有较好的发酵性能,可作为酸浆标准化生产的优良发酵菌种。

表2 10号菌株遗传稳定性测定Table 2 The stability of genetic

2.5 10号菌遗传稳定性测定

将10号菌株分别在黄浆水液体培养基中传代10次,测定每一代的产酸情况,结果如表2所示:

由表2中可知,10号菌株在液体培养基中连续传代10代,乳酸产量基本保持不变,说明此菌株在液体培养基中遗传稳定性较好,可作为酸浆老汤制作所用的发酵菌种。

2.6 10号菌菌种鉴定结果

2.6.1 菌落、菌体形态的鉴定结果 将10号菌株接种在MRS固体平板上37℃培养48h后,菌落呈圆形、表面突起,边缘整齐,不透明,白色(如图5所示)。对固体平板上的菌株进行革兰氏染色,发现该菌体为球形,四联或成串排列,直径约为0.8μm(如图6所示)。

图5 10号菌在MRS培养基中的菌落形态Fig.5 Colony morphology of 10 on MRS

图6 10号菌的菌体形态Fig.6 Cellular morphology of 10

2.6.2 10号菌生理生化的鉴定结果 对10号菌进行生理生化的常规鉴定实验,发现10号菌表现为45℃生长,产生黄色素,发酵甘油产酸,水解马尿酸,同时对照API 鉴定系统数据库中的细菌编码,可初步判断10号菌为肠球菌属,生理生化表型特征结果如表3所示:

表3 10号菌生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 10

2.6.3 10号菌分子生物学的鉴定结果 10号菌株16S rDNA的基因序列测序结果为:

图7 10号菌株的16S rDNA的系统发育数Fig.7 16S rDNA phylogenetic tree of 10

将10号菌的序列提交GenBank,通过Blast程序与其中的核酸数据库进行比对,结果表明与该序列相似度高的相关菌株均为肠球菌属,系统发育分析得出该菌与EnterococcuslactisBT159T(GU983697)和EnterococcusfaeciumATCC 19434T(DQ411813)两株菌在同一分支上,亲缘关系最近,相似性达99.7%以上,再结合形态特征、生理生化特征,可以初步确定该菌为肠球菌属中的屎肠球菌。

3 结论

通过本研究,从六个不同来源的酸浆老汤中分离纯化到12种菌落形态不同的乳酸菌株,并筛选出5株(3号、7号、9号、10号及11号)产酸的乳酸菌株,根据产酸能力的测定,最终筛选到1株产酸高且遗传稳定性较好的乳酸菌种。经菌种鉴定,该菌为肠球菌属中的屎肠球菌。将该菌种接种于灭菌的黄浆水中于37℃培养24h,可获得pH为3.26的酸浆,与酸浆老汤的pH(3.5)相近,此酸浆经进一步实验,可制作成酸浆豆腐。

今后可将此菌作为酸浆标准化生产的发酵菌种,为酸浆及酸浆豆腐的标准化生产提供了有力的保证。也可用于直接发酵豆浆,制作发酵豆腐[11-12]。

[1]乔支红.乳酸菌发酵延长豆腐保质期及抑菌机理的研究[D].北京:中国农业大学,2008.

[2]尹向垄,惠明,田青.豆腐酸浆中一株解淀粉乳杆菌的分离鉴定[J].中国酿造,2012,31(4):95-98.

[3]于海峰,宋俊梅,刘庆军，等.发酵大豆乳清的乳酸菌的分离筛选研究[J].食品科技,2004(4):93-95.

[4]张彬,柳珊,吕莹,等.云南石屏豆腐凝乳黄浆水中菌株的分离及产酸能力比较[J].食品工业科技,2011,32(4):189-196.

[5]张刚.乳酸细菌-基础、技术和应用[M].北京:化学工业出版社,2006:435.

[6]李启隆,胡劲波主编.食品分析科学[M].北京:化学工业出版社,2010:50.

[7]布坎南 R E.伯杰细菌鉴定手册[M].中国科学院微生物研究所译.北京:科学出版社,1984.

[8]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[K].北京:科学出版社,2001.

[9]唐鑫,陈卓然,黄新安,等.豆制品生产中黄浆水的综合利用[J].农产品加工,2010,4:97-98.

[10]Qiao Z H，Chen X D，Cheng Y Q，etal. Microbiological and chemical changes during the production of acidic whey,a traditional Chinese tofu-coagulant[J]. International Journal of Food Properties. 2010,13:90-104.

[11]刘恩岐,乔支红. 发酵布丁豆腐生产工艺的研究[J].食品科学,2006,27(6):128-130.

[12]乔支红,许荣华,程永强. 无凝固剂发酵豆腐生产工艺的初探[J].食品工业科技,2014,35(17)：227-231.

Isolation and identification of acid-producing lacticacid bacteria from tofu acid whey

QIAO Zhi-hong1,LI Yan-fang2,XU Rong-hua1,JIANG Hui1,ZHANG Qi1,XIU Yu1

(1.Tourism Insititute of Beijing Union University,Beijing 100101,China；2.Beijing Municipal Food and Wine Products Quality Supervision and Inspection Station,Beijing 100075,China)

12 strains of lactic acid bacterium were isolated from 6 different tofu acid whey from Shandong zouping,Shanxi yulin,Hebei laiyuan,Yunnan shiping,Yunnan jianshui and Yunnan yuanyang by MRS selective medium. 12 strains of lactic acid bacterium were preliminary screed by MC selective medium. On the basis of the measurement of fermented tofu whey’s pH values and lactic acid production in different fermented time,the high acid producing strain was screened out. The identification tests of colony morphology,physiology and biochemistry and 16S rDNA sequence analysis were studied for the acid producing strain. The results showed that the strain was gram-positive,circular,white,surface convex,opaque,and entire. According to physiology and biochemistry and 16S rDNA sequence analysis,the strain was identified asEnterococcusfaecium.

tofu acid whey;isolation;identification;Enterococcusfaecium

2014-04-17

乔支红(1976-)，女，博士，讲师，研究方向：中国传统大豆制品。

北京市教委科研计划(81106991314)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.029