张静 何其瑞 金玉林 周小菊

流式细胞术检测HLA-B27对辅助诊断AS作用的评估

张静 何其瑞 金玉林 周小菊

目的 评估流式细胞术HLA-B27检测对强直性脊柱炎(AS)的临床诊断价值。方法 对438例均经过X线检查的患者用流式细胞仪法进行HLA-B27检测, 计算各项诊断性能指标, 并与X线检查结果进行比较分析。结果 流式细胞术HLA-B27检测试验的灵敏度、特异性、准确度和约登指数分别为89.3%、93.1%、91.3%、0.824。两种诊断方法差异无统计学意义(P=0.424＞0.05), 而且吻合度较好(к=0.885＞0.7)。另外有7例(3.5%)AS患者X线检查正常而HLA-B27阳性。结论 流式细胞术HLA-B27检测对AS的诊断价值较高, 适合于临床常规检测。

流式细胞仪；HLA-B27；强直性脊柱炎；X线检查

HLA-B27基因是HLA-Ⅰ类分子B位点上一个重要的等位基因, 位于人类第6号染色体短臂上。该基因编码的抗原几乎表达在所有有核细胞上, 尤其淋巴细胞表面含量最为丰富。HLA-B27分子的免疫功能主要有负责细胞之间的相互识别, 诱导免疫反应和调节免疫应答等。早在1973年Brewerton等就发现HLA-B27表达与AS关系密切［1］。后来的研究证实：HLA-B27抗原表达与AS呈高度相关性, 超过90% AS患者HLA-B27抗原阳性［2-4］, 而正常人群HLA-B27阳性率只有5%左右。迄今为止, 在发现的所有HLA抗原与疾病关联中, HLA-B27与AS的相关性最强最典型［5］。因此, HLA-B27检测对AS的临床诊断和鉴别诊断具有重要意义。本院在2007年开展了HLA-B27流式细胞术检测技术, 至今已检测标本3000多例。为评估本院开展的HLA-B27检测试验对AS的临床诊断能力, 作者回顾性研究了本院检测HLAB27的438例患者病历资料, 并对相关数据进行统计学分析,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年1～7月本院相关科室均经过X线检查的438例患者, 男323例, 女115例, 年龄14～57岁, 平均年龄(30.1±9.2)岁。其中, 结合临床症状和多种检测手段最终被医师确诊为AS的患者201例［男163例, 女38例, 平均年龄(26.4±6.1)岁］, 非AS患者237例。

1.2 仪器与试剂 FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司),配套HLA-B27检测试剂盒(包括Anti-HLA-B27 FITC/CD3, HLA-B27 Calibtation beads for FL1, FACS溶血素等)。

1.3 方法 用EDTA抗凝的真空采血管采集2 ml外周血。取50 μl抗凝全血, 加入30 μl Anti-HLA-B27 FITC/CD3混匀,室温避光静置15～30 min。加入2 ml用蒸馏水1∶10稀释的溶血素, 低速混匀, 室温避光静置10～12 min后立即300 g离心5 min, 弃上清。加入2 ml PBS, 混匀静置5 min, 200 g离心后弃上清。加入0.5 ml PBS, 低速混匀, 固定30 min。对仪器进行调试后启动软件进行样本HLA-B27的自动分析。根据定标微球确定界值, 若样本FL1平均荧光强度大于或等于界值判断为阳性, 小于界值为阴性,见图1, 图2。

1.4 统计学方法

1.4.1 为评价X线检查和流式细胞术HLA-B27检测对AS的诊断价值, 以临床医师的最终诊断为金标准, 分别计算该两种诊断方法的灵敏度、特异性、准确度和约登指数, 计算公式如下：

灵敏度=［TP/(TP+FN)］×100% (TP:真阳性数, FN：假阴性数)

特异性=［TN/(TN+FP)］×100% (TN:真阴性数, FP：假阳性数)

准确度=［(TP+TN)/(TP+TN+FN+FP)］ ×100%约登指数=灵敏度+特异性-1

1.4.2 用SPSS19.0统计学软件对数据进行配对资料McNemar检验, 一致性检验采用к系数检验。P＜0.05为差异有统计学意义, к≥0.7表示吻合度较强。

2 结果

2.1 201例确诊的AS患者中HLA-B27阳性者有184例,阳性率为91.5%。237例非AS患者中HLA-B27阳性者有16例, 阳性率为6.8%。两种方法各项诊断性能指标见表1。

图1 HLA-B27阳性标本

图2 HLA-B27阴性标本

2.2 用流式细胞术对438例患者进行HLA-B27的检测结果与X线检查比较, 差异无统计学意义(P=0.424＞0.05)；к=0.885＞0.7,说明两种方法具有较强的吻合性, 见表2。

表1 X线和HLA-B27检测方法的灵敏度、特异性、准确度和约登指数(n, %)

表2 438例疑似患者HLA-B27检测和X线检查结果比较(n)

3 讨论

AS是一种主要累及脊柱、骶髂关节的慢性进行性疾病,发病较为隐匿。AS多见于15～30岁的男性青少年, 男女比例约为3：1［6,7］［本次调查研究AS平均发病年龄(26.4±6.1)岁, 男女患病比例约为4.3：1］。虽然其确切病因和发病机制尚不十分清楚, 但许多研究表明遗传和环境因素起着至关重要的作用。临床诊断AS主要依靠临床表现和影像学检查,如X线、CT和MRI等。但由于CT和MRI价格昂贵等原因, X线检查仍是该病的基础诊断方法。中晚期出现骶髂关节炎时, X线显示关节边缘模糊, 并稍致密, 关节间隙加宽等。但在发病初期骶髂关节炎的这些表现并不明显, 因此早期单靠X线难以确诊。

HLA-B27抗原是强直性脊柱炎的一个重要遗传标记。多项家族调查研究也发现B27是重要的AS预判指标, 因为B27阴性个体患AS的几率几乎为零, 而阳性个体患病几率达到20%～30%［8-10］。因此, HLA-B27可以作为常规筛选指标,对AS的诊断、预防和预后判断都有重要意义。目前HLA-B27的常用检测方法有ELISA、补体依赖的微量淋巴细胞毒试验、PCR和流式细胞仪法等。其中, 流式细胞仪法自动化程度高,操作简便, 重复性好, 结果判断准确, 是目前比较理想的检测方法。BD公司的一份流式细胞术临床研究手册表明用流式细胞仪来检测HLA-B27表达的特异性高达97.4%。

本实验采用流式法对438例患者进行HLA-B27检测,结果显示201例AS患者中HLA-B27阳性率为91.5%, 而非AS人群中HLA-B27阳性率仅为6.8%, 与以前的文献报道相近［2-4］, 强烈提示HLA-B27抗原表达与AS密切相关。经计算流式法 HLA-B27检测的灵敏度、特异性、准确度和约登指数分别为89.3%、93.1%、91.3%、0.824,各项性能指标的整体水平较好, 说明HLA-B27检测对AS的检出能力较高。经配对资料McNemar检验, P＞0.05, 两种方法检出率差异无统计学意义, 另外经к系数检验, к=0.885＞0.7, 说明两种方法具有较好的符合率。

另外作者发现确诊的AS患者中有7例(3.5%)X线检查正常, 但HLA-B27检测阳性, 这表明并行HLA-B27检测具有重要的临床意义, 是十分必要的。

［1］ Brewerton DA, Hart FD, Nicholls A, et al.Ankylosing spondylitis and HL-A 27.Lancet, 1973, 1(7809):904-907.

［2］ Seip MT, Erali M, Wies RL, et al.HLA-B27 typing: evaluation of an allele-specfic PCR melting assay and two flow cytometric antigen assay.Cytometry B Clin Cytom, 2005, 63(1):10-15.

［3］ Reveille JD.The genetic basis of spondyloarthritis.Ann Rheum Dis, 2011, 70(1):i44-i50.

［4］ Brown MA.Non-major-histocompatibility-complex genetics of ankylosing spondylitis.Best Pract Res Clin Rheumatol, 2006, 20(3): 611-621.

［5］ Thomas GP, Brown MA.Genomics of ankylosing spondylitis.Discov Med, 2010,10(52):263-271.

［6］ Zink A, Braun J, Listing J, et al.Disability and handicap in rheumatoid arthritis and ankylosing spondylitis-results from the German rheumatological database.German Collaborative Arthritis Centers.J Rheumatol, 2000, 27(3):613-622.

［7］ Sampaio-Barros PD.Epidemiology of spondyloarthritis in Brazil.Am J Med Sci, 2011, 341(4):287-288.

［8］ Cidem M, Sahin Z, Aydin T, et al.Somatosensory evoked potential findings in ankylosing spondylitis.Eurasian J Med, 2014, 46(1):42-46.

［9］ van der Linden S, Valkenburg HA, Cats A.Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis.A proposal for modification of the New York criteria.Arthritis Rheum, 1984, 27(4):361-368.

［10］ van der Linden SM, Valkenburg HA, de Jongh BM, et al.The risk of developing ankylosing spondylitis in HLA-B27 positive individuals.A comparison of relatives of spondylitis patients with the general population.Arthritis Rheum, 1984, 27(3):241-249.

Evaluation of HLA-B27 detection by flow-cytometry for effect of assisted diagnosis of AS

ZHANG Jing, HE Qi-rui, JIN Yu-lin, et al.
Department of Blood Transfusion, Xinyang City Central Hospital, Xinyang 464000, China

Objective To evaluate the clinical diagnosis value of HLA-B27 detection by flowcytometry for ankylosing spondylitis (AS).Methods Flow-cytometry was applied for 438 patients under X-ray examination to detect their HLA-B27.Indicators of diagnostic performance were calculated, and were compared with X-ray examination outcomes.Results The sensitivity, specificity, accuracy, and Youden index of flow-cytometry in detection of HLA-B27 were respectively 89.3%, 93.1%, 91.3%, and 0.824.There was no statistically significant difference between these two diagnosis methods (P=0.424＞0.05), and both methods had good coincidence rate (к=0.885＞0.7).There were another 7 cases (3.5%) with AS had normal result in X-ray examination along with positive HLA-B27.Conclusion Flow-cytometry provides high diagnostic value for AS through its detection of HLA-B27, and it is worth being applied in clinically conventional detection.

Flow-cytometry; HLA-B27; Ankylosing spondylitis; X-ray examination

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.11.008

2014-11-21］

464000 信阳市中心医院输血科