王杰 赵丽霞 雷建都 何静 郭利群

摘  要  采用单因素试验，考察乙醇浓度、时间、温度、液固比对枇杷叶中熊果酸提取率的影响。再通过三因素三水平的响应面分析法优化枇杷叶中熊果酸的提取工艺，建立二次项数学模型，验证模型的可靠性，并对熊果酸粗品进行纯化。结果表明：最佳提取工艺为乙醇浓度95%，温度85 ℃，时间2.8 h，液固比（mL ∶ g）15 ∶ 1。此条件下枇杷叶中熊果酸的提取率为95.4%。熊果酸粗品经纯化后，纯度可达54.6%。

关键词  枇杷叶;熊果酸;提取;响应面分析;纯化

中图分类号  R284.2          文献标识码  A

Study on Optimization of Extraction Technology of

Ursolic Acid from Eriobotrya japonica Leaves by

Response Surface Method and its Purification

WANG Jie1， ZHAO Lixia1， LEI Jiandu1， HE Jing1 *， GUO Liqun2 *

1 College of Materials Science and Technology， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China

2 Yunnan pharmaceutical industry Co.， Ltd， Kunming， Yunnan 650106， China

Abstract  The optimal extraction technology for the ursolic acid from Eriobotrya japonica leaves is presented in this paper. Firstly， three main factors including ratio of alcohol to water， ratio of liquid to solid， temperature， and extracting time were studied by using single factor analysis method. Then the optimal extraction process was determined by response surface methodology in three factors and three levels， the quadratic mathematical model for extraction was established， and its reliability was verified. Finally the extracted ursolic acid was purified. The optimum extraction technology of ursolic acid is as following： alcohol-water ratio 95%， treatment time 2.8h， temperature 85℃， and liquid-solid ratio 15：1 （mL：g）. Under this condition， the yield and purity of ursolic acid from Eriobotrya japonica leaves was 95.4% and 54.6% respectively.

Key words  Eriobotrya japonica leaves; Ursolic acid; Extraction; Response surface methodology; Purification

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.026

枇杷[Eriobotrya Japonica（Thunb.）Lindl.]是蔷薇科植物，枇杷叶具有止咳化痰、清热解暑，生津止渴的功效，其对支气管炎、肺热咳嗽等疾病具有良好的疗效[1]。熊果酸（ursolic acid，UA），又称乌苏酸，属五环三萜类化合物，分子式见图1所示。熊果酸在枇杷叶中含量较高，具有抗氧化[2]、抗肝损伤[3]、抗动脉硬化[4]、抗炎[5]、降血脂[6]等功效。熊果酸在皮肤美白、皮炎预防及治疗等方面具有药物功效。因此，充分开发利用枇杷叶中熊果酸资源，提高其药用价值，具有很大的前景，既有社会意义又有经济意义。

目前，传统溶剂法、超声辅助提取法、超临界流体萃取法等是从植物中提取熊果酸的主要常用方法[7]。超声辅助提取法缩短了提取时间，加速了萃取过程，但是受超声波设备功率限制，大规模生产的经济性较低，其安全性也有待验证[8-9];超临界流体萃取法有效成分提取率较高，产品纯度较好，但由于操作压力大，能耗高，不可连续化生产，不易于工业化[10]。溶剂法中的乙醇回流提取整个工艺使用环保的溶剂乙醇和水，符合环境友好化学的理念，操作简单，经济安全，大规模化生产投资较少[11-12]，而且为后续纯化工艺带来了便捷。响应面法优化熊果酸提取工艺在影响因素相同的情况下，实验数比中心组合设计和正交设计更少，更经济，可广泛应用于中药提取、分析检测、化学合成等领域，目前采用本方法提取熊果酸的相关研究较少。因此，本研究采用响应面分析法对提取枇杷叶中熊果酸的主要工艺参数进行优化，为工业化生产提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  实验材料与仪器

枇杷叶于2014年7月下旬采自广西桂林，属于大五星品种，洗净后真空干燥（50 ℃）、粉碎过60目筛;熊果酸（图1）标准品（纯度>98%），购自成都普菲德生物技术有限公司;AB-8大孔吸附树脂，购自安徽三星树脂科技有限公司;硫酸、氢氧化钠、乙醇等均为分析纯，无水甲醇为色谱纯。

8302型恒温水浴锅，余姚金电仪表有限公司;DHG-9036A型电热恒温鼓风干燥箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司;ATX124型分析天平，日本岛津公司;PHS-25精密pH计，上海雷磁仪器厂;LC3000型高效液相色谱仪，北京创新通恒科技有限公司。

1.2  方法

1.2.1  色谱条件[13-14]   Cosmosil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：无水甲醇-0.05%磷酸水溶液（88 ∶ 12，V/V）;柱温：25℃;流速：1 mL/min;检测波长：220 nm;进样量：20 μL;灵敏度：0.05AUFS。

1.2.2  标准曲线绘制   精确称取熊果酸标准品4.5 mg，溶解于含有10 mL无水乙醇的容量瓶中，制成浓度为0.45 mg/mL的标准品溶液。将标准溶液分别稀释得到不同浓度的熊果酸标准品溶液进行测定。Y为峰面积，X为质量浓度（mg/mL），结果显示Y与X线性关系良好。其峰面积和质量浓度呈线性相关，回归方程为：Y=2 400 000X+1 787.6，r=0.999 9，r为相关系数。

1.2.3  熊果酸的提取试验   （1）单因素试验。称取适量枇杷叶细粉，分别在不同的乙醇浓度、温度、时间以及液固比条件下回流提取2次，试验重复3次，取平均值。合并提取液，过滤，定容，取上清液，用高效液相色谱仪对其含量进行测定。

（2）响应面法优化试验。结合单因素试验结果，取自变量为时间（A）、温度（B）、液固比（C），响应值（Y）为熊果酸提取率，根据中心组合试验Box-Benhnken设计3因素3水平试验方案，见表1，试验重复3次，取平均值。使用曲面响应法对试验结果进行分析，确定各因素之间的交互作用对熊果酸中枇杷叶提取率的影响，优化工艺条件。

1.2.4  纯化   （1）酸碱纯化法。按照相关文献[15]进行酸碱纯化处理，重复3次取平均值，采用高效液相色谱仪测定熊果酸的纯度。

（2）大孔吸附法。根据相关文献[16]，选取比表面积较大的AB-8大孔吸附树脂，考察静态吸附时间与熊果酸吸附量的关系，重复3次取平均值。采用高效液相色谱仪测定熊果酸的纯度。熊果酸吸附量qe计算公式如下：

qe=（C0-Ce）×V/W

其中：C0为吸附前溶液中熊果酸浓度（mg/mL）;Ce为吸附后溶液中熊果酸浓度（mg/mL）;V为溶液的体积（mL）;W为大孔吸附树脂吸附剂质量（g）;

1.2.5  原料中熊果酸含量计算   称取适量枇杷叶细粉，用95%乙醇溶液在圆底烧瓶中回流提取多次，直至高效液相色谱无法检测出熊果酸。将所有提取液合并浓缩，定容至100 mL，采用高效液相色谱仪测定原料中熊果酸含量，试验重复5次，取平均值。

C=100×a×10-3/m

式中，C为枇杷叶中熊果酸含量（g/g），a为所测浓度（mg/mL），m为枇杷叶的质量（g）。

1.2.6  提取率计算   Y=C1/C2×100%，其中，Y为熊果酸提取率，C1为每次提取液经过高效液相色谱仪测定所得（g/g），C2为“1.2.5”式中所测得（g/g）。试验重复3次，取平均值。

2  结果与分析

2.1  单因素试验结果与分析

2.1.1  乙醇浓度对提取率的影响   提取温度为85℃，提取时间为3 h，液固比（mL ∶ g）为10 ∶ 1时，乙醇浓度对提取率的影响见图2所示。由图2可知：乙醇浓度在70%～100%范围内，随着乙醇浓度的增加，熊果酸的提取率也升高;当乙醇浓度超过90%，提取率显著升高;当乙醇浓度大于95%，熊果酸提取率增加不明显，趋于稳定。由于熊果酸属于五环三萜类化合物，极性较弱，根据相似相容原理，乙醇浓度在95%时，其极性与熊果酸相近，此时熊果酸在溶剂中溶解度达到最大，提取率显著升高。

2.1.2  温度对提取率的影响   温度与传质速率呈正相关，所以传质速率随着温度升高而增大，同时，温度升高使得溶剂黏度和传质阻力减小，促进传质速率增大[17]。而温度过高，则会破坏熊果酸的内部结构，而且增加工业能耗，所以温度的选择很关键。

乙醇浓度为95%，提取时间为3 h，液固比（mL ∶ g）为10 ∶ 1时，温度对提取率的影响见图3所示。图3表明，70～95 ℃范围内回流提取，起初熊果酸的提取率随温度升高显著增加，达到85 ℃后，提取率缓慢增加到趋于稳定。由于随着温度升高，分子热运动增加，传质速率增大，而温度达到85 ℃，提取传质速率增加缓慢，熊果酸的提取率趋于稳定;若温度过高，会破坏熊果酸的分子结构，影响提取率。

2.1.3  提取时间对提取率的影响   乙醇浓度为95%，温度为85 ℃，液固比（mL ： g）为10 ： 1时，提取时间对提取率的影响见图4。图4表明：0.5～3 h范围内，起初熊果酸提取率随着提取时间的延长而提高，当提取时间达到2.5 h后提取率趋于稳定。因为在提取初期，溶剂不断向枇杷叶内部扩散，溶解熊果酸，后期向溶剂主体扩散，直到两者浓度接近相同，最终扩散过程处于动态平衡。

2.1.4  液固比对提取率的影响   乙醇浓度为95%，温度为85 ℃，提取时间为3 h时，液固比对提取率的影响见图5。图5表明，液固比（mL ： g）在5 ： 1～25 ： 1范围内，当液固比（mL ： g）小于10 ： 1，枇杷叶中熊果酸的提取率随液固比的增大而显著提高，这是因为溶剂的增加加快了溶质的传质速率，使得提取率显著提高。但当液固比（mL ： g）大于10 ： 1，熊果酸提取率提高缓慢。原料一定时，若溶剂用量太大，则工业化生产的成本升高，考虑到熊果酸提取率和生产效益，选择液固比（mL ： g）为10 ： 1较为合适。

2.2  响应面试验结果与分析

2.2.1  响应面法试验结果   在单因素试验的基础上，进行3因素3水平正交试验，结果见表2所示。

2.2.2  模型的建立及其显著性检验   通过Design Expert 8.0.6软件对表2中熊果酸提取率进行处理，得回归方程：Y=0.88+2.500E-003A+0.081B+0.066C-0.012AB+0.073AC+1.000E-002BC-0.047A2-0.13B2-0.059C2

由表3知，回归方程F值为10.12，相关系数R2=0.948 0，p<0.05，说明回归方程拟合较好，本试验可信性和准确性高;失拟项（p值为0.066 6）不显著说明试验误差很小。

2.2.3  响应面法对提取工艺的分析与优化   根据以上回归模型，可以拟合出相应的三维球面图与二维等高曲线图（图6～8），通过三维图与曲线图，可看出试验水平与每个变量或变量之间交互影响的响应值之间的关系。根据等高线的形状可以判断变量之间交互影响的显著性。圆形等高线表明两变量之间的交互影响不显著;椭圆形等高线表明两变量之间的交互影响显著[18-19]。

图6表明，提取时间一定时，在75～90 ℃范围内，熊果酸的提取率随着提取时间的增加而明显升高;在90 ℃左右出现极值;之后继续提高温度，提取率下降。沿温度方向的等高线密度变化相对时间方向高，说明温度对熊果酸提取率的影响大于时间的影响。

图7表明，当液固比（mL ： g）大于10 ： 1，时间在1～3 h范围内，随着时间的增加熊果酸提取率升高，且在1～2.5 h内熊果酸提取率升高显著。

图8表明，同一液固比下，在75～95 ℃范围内，随着温度的升高，熊果酸提取率升高;在90 ℃左右，提取率达到极值。且在75～90 ℃范围内熊果酸提取率升高显著。等高线密度沿温度方向变化较大，说明温度对提取率的影响大于液固比的影响。

2.2.4  较优提取条件验证   为验证响应面法的可行性，在优化条件下提取枇杷叶熊果酸，考虑到实际操作，将工艺参数修正为：提取时间2.8 h，温度85 ℃，液固比（mL ： g）15 ： 1。在此条件下进行3次重复实验，平均提取率为95.4%，相对标准偏差为1.4%，熊果酸提取量为8.78 g/kg，表明提取实验的重复性和精密度较好。模型预测的最大提取率为93.3%，比验证实验的平均提取率95.4%低2.1%，表明模型预测值与实验值之间拟合良好，验证了模型的有效性。

2.3  熊果酸的纯化

从图9可以看出，当吸附时间在0～150 min内，熊果酸吸附量随着时间的延长而增大，90 min时吸附基本饱和，此后逐渐趋于平稳。AB-8树脂对熊果酸的吸附速率随时间而变化，0～50 min内吸附速率较快，50 min以后吸附速率减缓，90 min以后吸附饱和，为了节约时间和生产成本，选择吸附时间为90 min。熊果酸吸附量与吸附时间的关系拟合为：y=-0.000 8x2+0.192 2x+1.586 7，R2=0.976 2，y为熊果酸吸附量（mg/g），x为吸附时间（min）。

通过乙醇对枇杷叶中熊果酸进行提取，选择酸碱处理法和AB-8大孔吸附树脂对粗提物进行纯化。从图10可以看出，未处理的熊果酸纯度为7.4%，酸碱处理法纯化后熊果酸纯度为32.3%，酸碱处理及AB-8吸附树脂纯化后熊果酸纯度为54.6%。与已有的报道相比[20]，纯化效果较好。

熊果酸标准品、枇杷叶提取液、纯化后熊果酸高效液相色谱图分别见图11～13，通过对比可以看出，经过酸碱沉淀处理和AB-8大孔吸附树脂纯化后，熊果酸HPLC图谱杂峰减少，纯度增加。

3  讨论与结论

本研究通过单因素试验和响应面分析法得到了提取枇杷叶中熊果酸的较优条件，利用Design Expert软件优化了枇杷叶中熊果酸的提取工艺，并建立二次多项式回归模型，通过方差分析、响应面分析和验证试验表明该模型可靠，可以较准确地预测熊果酸的实际提取率。

由响应面分析法优化提取枇杷叶中熊果酸的3个因素：温度、提取时间、液固比，得出其主次关系为：提取时间>液固比>温度，结合单因素试验，优化提取条件为：乙醇浓度95%，温度85 ℃，提取时间2.8 h，液固比（mL ∶ g）15 ∶ 1，此条件下熊果酸提取率可达93.3%，熊果酸提取量为8.78 g/kg，验证实验的平均提取率为95.4%，预测值与实验值间拟合良好，证实了模型的有效性。超声波辅助法和亚临界水法提取枇杷叶中熊果酸的提取时间少于回流提取法，但是提取率均较低[21-22]。响应面法优化后的乙醇提取工艺使得熊果酸的平均提取率达到95%以上。在熊果酸的纯化过程中，酸碱纯化法去除了杂质中的叶绿素及大极性物质，大孔吸附树脂法除去了的多酚、黄酮等杂质，两者结合使用，操作简单易行，纯化效果较好，熊果酸纯度可达54.6%，该研究为熊果酸的工业化提取纯化提供了高效绿色途径。

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