庞国防 梁庆华 吕泽平 胡才友 黄东挺 周博峰 黄春丽 余天智 唐凤川 潘尚领 彭均华

(广西自壮族自治区江滨医院神经内科，广西 南宁 530021)

5%～10%的帕金森病(PD)患者表现为常染色体显性或隐性遗传，因此，对遗传易感基因的筛查成为近期研究PD的热点之一〔1〕。欧洲、美洲人群及日本等东亚主要群体的病例-对照研究及全基因组关联分析结果显示，帕金森病蛋白(PARK)2和富亮氨酸重复激酶(LRRK)2基因的一些单核苷酸多态性(SNP)分别在常染色体隐性早发(50岁前发病)及常染色体显性晚发(50岁后发病)PD的发病中可能扮演重要的角色，而且呈现明显的群体及地域特异性〔2～4〕。至今 PARK2及 LRRK2基因已发现约150个 SNPs与PD关联〔2〕，其中部分 SNP已在沈阳、江苏、湖南等地区的汉族人群中得到重现〔5～7〕。罗曙光等〔8〕也发现该基因第10外显子的V380L多态性与广西地区汉族女性PD的遗传易感性有关。但至今，壮族群体PD的遗传流行病学尚无报道。本研究结合东亚人群常见的PD相关基因变异，对广西壮族散发性PD患者PARK2及LRRK2基因5个SNP进行基因分型，了解这些基因多态性与广西壮族PD发病的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 (1)PD组:2011年5月至2013年12月我院收治的散发PD患者，无明显家族史，共112例，年龄(64.29±12.93)岁，其中男59例，女53例，均为壮族，主要来自南宁及周边的百色、河池等地区，并以50岁为界分为早发及晚发亚组。均符合1992年英国帕金森病协会及中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组制定的诊断标准〔11，12〕，由两位资深神经内科医生共同确定诊断。(2)对照组:为来自相同地区，年龄、民族、性别构成与PD组匹配的健康中老年人156例，年龄(62.85±11.62)岁，男84例，女72例。研究对象除了详细的神经系统检查外，常规的体格检查及身高、体重、血压等临床数据亦一并采集。研究对象均知情并同意。PD组的饮酒比例、BMI、收缩压、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)均明显大于对照组(均P＜0.05)，而吸烟的比例小于对照组(P＜0.05)，两组性别构成及年龄构成、舒张压、低密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)无明显差异(P＞0.05)。见表1。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 所有研究对象禁食12 h后于清晨空腹采肘静脉血8 ml，其中3 ml ACD抗凝血用于白细胞基因组DNA提取，5 ml非抗凝血分离血清后用于血脂测定。

1.2.2 DNA提取 采用经典的酚-氯仿法。

1.2.3 血脂测定 血清TC、TG采用酶法，HDL-C、LDL-C采用酶联免疫一步法，试剂盒购自申能试剂公司。

1.2.4 SNP基因分型 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)进行分型，引物参考文献〔7～10〕进行设计，由上海生工公司合成。各SNP的基本特征、引物序列、PCR退火温度、内切酶种类、酶切产物大小等数据见表1。PCR反应总体积为20μl，其中2×Taq Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)10 μl，上、下游引物(0.2 μmol/μl)各1 μl，Taq DNA 聚合酶〔宝生物工程(大连)有限公司〕1 U，基因组 DNA 200 ng(1μl)及ddH2O 7μl。SNP rs1801582的 PCR条件:94℃预变性5 min后，94℃变性 40 s，59℃ 退火 40 s，72℃ 延伸 50 s，35 个循环，再72℃延伸10 min。取10μl PCR产物加入0.2 U限制性内切酶Bsp1286 I〔宝生物工程(大连)有限公司)，72℃水浴消化4 h，然后取酶切产物8μl在2%琼脂糖凝胶中80 V电泳30 min。rs1801582的PCR产物为165 bp，酶切产物电泳后仅出现1条带者(165 bp)为GG野生纯合型，出现3条带型(165，107，58 bp)者为GC杂合突变型，出现2条带型(107，58 bp)者为CC纯合突变型。其余4个SNP的PCR-RFLP体系、条件及带型特点见表2。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0软件。本研究中TG为正偏态资料，对数转换后为正态分布，以中位数表示，P值均已经对数转换，其余符合正态分布的计量资料以±s表示。基因频率用直接计数法计算。Hardy-Weiberg平衡采用拟合优度χ2检验。两组计量资料的组间比较采用t检验，两组以上比较采用方差分析。分类资料组间比较采用χ2检验。

表1 研究对象的基本临床特征(±s)

表1 研究对象的基本临床特征(±s)

临床特征 PD组(n=112)对照组(n=156)P值64.29±12.93 62.85±11.62 0.045性别〔n(%)〕 男 59(52.7) 84(53.8) 0.96女53(47.3) 72(46.2)年龄〔n(%)〕 ≤50岁 42(37.5) 76(48.7) 0.062＞50岁 70(62.5) 80(51.3)吸烟〔n(%)〕 是 29(25.9) 59(37.8) 0.002否83(74.1) 97(62.2)饮酒〔n(%)〕 是 20(17.9) 19(12.2) 0.039否92(82.1) 137(87.8)BMI(kg/m2) 22.51±3.43 21.14±3.17 0.041收缩压(mmHg) 136.23±28.14 129.45±25.31 0.034舒张压(mmHg) 87.21±13.65 84.76±12.28 0.056 TC(mmol/L) 5.08±1.01 4.91±0.94 0.038 TG(mmol/L) 0.97(0.49) 0.93(0.47) 0.026 HDL-C(mmol/L) 1.58±0.38 1.62±0.37 0.122 LDL-C(mmol/L)年龄(岁)3.00±0.86 2.82±0.80 0.017

表2 各SNP的基本特征及基因分型策略

2 结果

5个SNP的分布均符合H-W平衡。在PARK基因的多态位点rs45530340，T等位基因携带者罹患PD的风险约为正常人群的2.252倍(95%CI:1.186～3.517，P=0.009)。无论早发、晚发或总体，PD组的CT杂合基因型频率及T等位基因频率均明显高于对照组的相应亚组(P＜0.01～0.05)，PD组内的早发及晚发亚组基因型频率及等位基因频率无明显差别(P＞0.05)。在LRRK2基因的rs34778348位点，A等位基因携带者罹患PD的风险也明显升高(OR=1.632，95%CI:1.238～2.346)，但 P值稍弱，总体上PD组等位基因A及纯合突变型AA的频率高于对照组(P＜0.05)。另3个SNP的基因型和等位基因频率分布两组间无差异(P=0.445～0.894)。见表3。

表3 广西壮族人群散发性PD的相关基因及致病基因〔n(%)〕

3 讨论

PARK2基因也称为parkin或E3泛素蛋白连接酶基因，全长超过500 kb，包含12个外显子。Parkin可催化泛素分子与特异性底物的结合，并通过泛素-蛋白酶体系统降解这些目标底物〔9〕。早发性PD患者多数有PARK2基因的多重突变，而且这些突变会影响PARK2的一个或多个功能区并导致PARK2的功能改变〔2〕。LRRK2基因位于染色体12q，全长145 kb，包括51个外显子，编码含2575个氨基酸的dardarin蛋白(震颤蛋白)，其功能涉及到底物的结合、底物的磷酸化、蛋白-蛋白之间的交互作用等。例如，它直接使丝氨酸/苏氨酸激酶Akt1(亦称蛋白激酶B1)磷酸化而活化Akt1，而后者是生长激素及其受体之间信号转导的关键分子。正常的Akt1磷酸化/去磷酸化是确保神经细胞生存及凋亡平衡的重要基础。LRRK2的错义突变可导致不同程度的病理过程，例如R1441C、G2019S和I2020T突变明显减少Akt1的磷酸化，引起神经细胞的退行性改变，因此LRRK2被认为是家族性及散发性PD的重要分子〔11，12〕。

本研究的主要发现是，在广西地区壮族散发性PD患者中，PARK2 rs45530340(L63V)及LRRK2 rs34778348(G2385R)的频率明显高于对照组，携带rs45530340 T等位基因及rs34778348 A等位基因的个体患PD的风险是普通人群的2.252倍及1.632倍，但基因型及等位基因频率在早发和晚发PD之间无差异。因此，这两位点可能是壮族散发性PD的易感因素之一。此结果与张学伟及Zhou等〔5，6〕报道的西南汉族及沈阳汉族的结果基本一致，而与赵辉等〔7〕报道的淮海地区汉族有所不同，后者PARK2 rs45530340 T等位基因的频率虽与本结果类似，但PD组与对照组之间无差异(16.4%vs 20%，P=0.251);而在LRRK2 rs1491942位点，PD组的C等位基因频率明显高于对照组(43.4%vs 32.8%，P=0.006)。可见，PD与 PARK2及LRRK2基因的关联存在明显的群体特异性。

一些学者认为，PARK2基因的单碱基突变可导致早发性PD或是晚发PD的危险因素〔13〕。Wang等〔14〕在果蝇模型上发现，过度表达PARK2 R275W突变的个体呈现明显的多巴胺能神经退行性变和线粒体异常，与敲除Parkin基因的果蝇的表现相似，说明PARK2在维持线粒体功能稳定性方面起着重要的作用。但PARK2单碱基突变导致PD的病理遗传学机制尚有待进一步阐明，尤其对于多重杂合突变的个体，因为这些突变可能存在潜在的交互作用〔15〕。本研究中，虽然rs1801582在PD和对照人群中无明显差异，但却存在较高的GC杂合基因型频率，而且PD组PARK2 rs45530340杂合基因型CT的频率明显高于对照组，故不排除这两个杂合变异间的交互作用。

LRRK2被认为是家族性及散发性PD的重要分子〔6〕。本组病例LRRK2 rs34778348(G2385R)等位基因A携带者罹患PD的风险明显高于普通人群，与中国西南汉族及东亚主要群体的结果类似〔7，16〕。此位点位于LRRK2基因第48外显子的WD40结构域，使第7153号核苷酸G变成A，相应密码子GGG变成GGA，编码同样的氨基酸Gly，被认为是一种沉默的、中性的点突变，在多个西方群体中没发现PD患者与普通对照间的频率差异〔2〕。本组人群及其他东亚群体PD患者高频等位基因A的潜在生物学意义尚不清楚，与其他未知的致病突变存在连锁不平衡可能是其解释之一。本组病例没发现LRRK2 rs7133914(R1398H)的频率在两组人群中的差异，与 Chen等〔17〕报道的华南汉族的结果一致，但他们把已报道的其他汉族群体的结果合并后再分析发现，R1398H有降低PD风险的作用。他们认为，R1398H可能降低了Akt1激酶的活性而发挥其保护作用。至于其如何降低Akt1激酶的活性，目前还不清楚，可能是因为 R1398H位于 ROCO基序中的 ROC结构域，而ROCO具有鸟嘌呤酶活性，LRRK2负责ROC与无活性的GDP和有活性的GTP之间的切换，即当ROC结构域与GTP与结合时，LRRK2的活性增加，而与GDP结合时，活性降低。更重要的是，LRRK2与GTP或GDP结合主要取决于ROC的功能状态〔17〕。本研究没发现PARK2 rs1801582(V380L)在病例组及对照组之间的差异，与罗曙光等〔8〕报道的广西汉族群体的结果有所不同，这可能与两个研究样本大小、民族构成不同等有关。

本研究只检测华人群体常见的与PD关系较为密切的PARK2和LRRK2变异，故不能排除壮族PD患者这两个基因是否还携带其他的变异或存在其他基因重排。

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