代皓，郑磊，朱洪智，杨艳梅，陈凯

(1武警四川总队医院成都分院，成都610000;2沧州医学高等专科学校;3武警医学院附属医院)

肠道是应激的中心器官。在创伤、休克、严重感染时，全身血液重新分布，引起肠道严重缺血、缺氧性损害，随后的再灌注进一步加重肠道机械屏障功能破坏，严重者可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多脏器功能障碍综合征(MODS)［1］。高压氧预处理可以减轻多脏器的缺血再灌注损伤。2013年9月～2014年6月，我们利用经典的夹闭肠系膜上动脉的方法［2］复制大鼠肠道缺血再灌注损伤模型，观察高压氧预处理对正常及急性肠缺血再灌注机械屏障损伤大鼠的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠30只，体质量250～300 g(北京维通利华公司)，雌雄不拘。PBS(Sigma，美国)，葡聚糖蓝-2000(Sigma，美国)，髓过氧化物酶活力检测试剂盒(BioVision，美国)，TNF-α ELISA试剂盒(Sigma，美国)，甲醛(北京鼎国公司)，50%戊二醛(北京鼎国公司)。透明动物加压舱(上海杨园医用氧舱厂)，透射电子显微镜(Hitachi公司，日本)，ELx800光吸收酶标仪(BIOTEK，美国)，体视显微镜(Olympus，日本)，低温离心机(Sigma，美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将大鼠按随机数字表法分为假手术组(不阻断肠系膜上动脉，其他处理同缺血再灌注组)、缺血再灌注组(阻断肠系膜上动脉并再灌注)和高压氧预处理组(阻断高压氧预处理后阻断肠系膜上动脉并再灌注)各10只。实验前适应性喂养1周，22～25℃室温，普通饲料喂养。

1.2.2 高压氧预处理方案 高压氧预处理组动物置加压舱，舱底置新鲜钠石灰，纯氧洗舱10min，使舱内 O2浓度 ＞98%，CO2浓度 ＜0.05%，以0.1 MPa/min的速度加至0.25 MPa(绝对压)，高压停留60min(期间以纯氧通风10min)，舱内温度维持在22～24℃。暴露结束后，匀速减压15min至常压，出舱。2次/d，进舱时间分别为8:00和15:00，连续暴露2 d。实验过程中如有死亡，采用同标准的大鼠用同样的办法补充。

1.2.3 肠缺血再灌注模型建立 大鼠术前禁食12 h，自由饮水。备皮后常规麻醉、消毒、铺巾，上腹部沿正中线切口，暴露并在根部游离肠系膜上动脉，用小动脉夹夹闭，肠管还纳腹腔，腹部切口闭合，缺血45min后，从原切口再次入腹，松开肠系膜前动脉夹再灌注1 h。

1.2.4 肠道动力测量 缺血再灌注后，在距离大鼠的屈式韧带1cm处空肠内注入葡聚糖蓝-2000 0.4 mL，30min后大鼠颈椎脱臼处死，取出全部空肠测量空肠中葡聚糖蓝-2000推进距离及空肠全长，计算空肠推进率(葡聚糖蓝-2000推进距离/空肠全长×100%)。

1.2.5 TNF-α测定 用无热源注射器抽取大鼠肝门静脉血适量，取掉针头贴壁注入无热源管中;静置30min，离心 5min(3 500 r/min)，取得血清，使用TNF-α ELISA试剂盒，通过酶标仪测得492 nm处OD值，根据样品OD值，使用标准曲线公式换算出相应样品中TNF-α含量。

1.2.6 肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性测定 在距离回盲部1cm处取1cm长小肠，用冷生理盐水冲洗，清除黏液、污物等肠腔内容物后进行匀浆。使用髓过氧化物酶活力检测试剂盒，通过酶标仪测得412 nm处OD值;根据样品OD值使用标准曲线公式换算出相应样品中MPO含量。

1.2.7 光镜及透射电镜观察 在距离回盲部2cm处取1cm长小肠，用4%甲醛液固定，经梯度乙醇系列脱水，二甲苯透明后，常规石蜡包埋，HE染色，光学显微镜观察记录。在距离回盲部3cm处取面积为1 mm×1 mm的小肠组织，放入4%戊二醛固定，PBS漂洗，1%锇酸固定2 h，丙酮梯度脱水，树脂包埋，半薄切片定位，超薄切片，铀染，铅染，透射电镜观察。

1.2.8 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，三组间比较采用方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，率的比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组空肠动力比较 与假手术组比较，缺血再灌注组和高压氧预处理组的空肠推进长度和空肠推进率明显降低(P均＜0.01)。与缺血再灌注组相比，高压氧预处理组的空肠推进长度和空肠推进率明显改善(P均＜0.01)。见表1。

表1 各组空肠动力比较(n=10，±s)

表1 各组空肠动力比较(n=10，±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.01，与缺血再灌注组比较，#P＜0.01。

组别 空肠长度(cm)空肠推进长度(cm)空肠推进率(%)假手术组8.51±0.356 6.96±0.461 80.60±2.62缺血再灌注组 8.76±0.347 3.16±0.287* 37.90±3.49*高压氧预处理组 8.58±0.316 5.04±0.384*#59.50±2.50*##

2.2 光镜及电镜观察结果 光镜下，假手术组小肠黏膜保持完整，肠绒毛形态正常;缺血再灌注组黏膜下水肿、淤血，大量炎性细胞浸润，肠绒毛破坏，上皮细胞坏死，大量渗出，肠绒毛高度下降，数量减少;高压氧预处理组黏膜下血管轻微充血，少量炎性细胞浸润。电镜下，假手术组可见两个吸收细胞之间正常的紧密连接、中间连接和桥粒，小肠微绒毛排列整齐;缺血再灌注组微绒毛减少，紧密连接、中间连接部分融合、模糊不清或消失;高压氧预处理组微绒毛基本正常，细密，排列整齐，可见清晰的紧密连接、中间连接和桥粒。

2.3 各组MPO活性与血清TNF-α水平比较 与假手术组对比，缺血再灌注组和高压氧预处理组MPO活性、血清 TNF-α水平显著增高 (P均 ＜0.01);与缺血再灌注组相比，高压氧预处理组肠组织MPO活性、血清TNF-α水平降低(P均＜0.01)。见表2。

表2 各组肠组织MPO活性和血清TNF-α水平测定(n=10，±s)

表2 各组肠组织MPO活性和血清TNF-α水平测定(n=10，±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.01;与缺血再灌注组比较，#P＜0.01。

组别 MPO(U/g) TNF-α(pg/mL)假手术组0.05±0.006 29±5.461缺血再灌注组 0.18±0.025* 101±18.287*高压氧预处理组 0.11±0.024*# 55±12.384*#

3 讨论

完整的肠道功能包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障，其中以机械屏障最为重要［3］。机械屏障的结构基础为黏液层、完整的肠黏膜上皮细胞和上皮细胞间的紧密连接［4～7］。当机体遭受严重创伤、免疫力下降、便秘、严重感染、休克等情况时，可直接或间断破坏肠道机械屏障。

缺血再灌注损伤是组织器官在缺血的基础上恢复血流后，其自身损伤反而加重的现象。缺血再灌注损伤是创伤、严重感染及休克等疾病共同存在的病理生理过程，可导致许多严重并发症，是外科常见的组织器官损伤之一［8］。小肠是对缺血再灌注损伤最敏感的器官之一，在腹部外伤、失血性休克、肠绞窄、小肠移植和肠系膜血管缺血性疾病等情况下，均会造成小肠的缺血性损伤，在组织恢复血供时，再灌注损伤进一步加重对小肠的损伤，引起肠黏膜机械屏障损害，严重者可以导致 SIRS、MODS［9］。本实验中缺血再灌注组小肠上皮细胞坏死，大量炎性细胞渗出，紧密连接部分融合、模糊不清或消失。表明缺血再灌注损伤能够破坏大鼠肠道的机械屏障。

高压氧作为一种辅助治疗已经广泛应用于多种缺血再灌注损伤模型，如心肌、骨骼肌、脑、肝脏、肾脏等，并取得满意结果。Daniel等发现高压氧治疗能明显降低肠缺血再灌注后大鼠肠黏膜的凋亡指数。Chen等［10］证实，高压氧预处理能减少大脑炎性细胞的渗出，减少MDA的生成，增加ATP的产量，明显减轻大脑的再灌注损伤。Wada等［11］发现，高压氧预处理能提高热休克蛋白的表达，从而也揭示了高压氧预处理能使脑组织对缺氧缺血产生耐受的机制之一。有研究表明，高压氧预处理可模拟缺血预处理，诱导脊髓缺血耐受，而且高压氧预处理诱导的脊髓缺血耐受效应可以被氧自由基清除剂二甲基硫脉消除，证实氧自由基在高压氧预处理机制中具有重要意义。由于自由基与抗氧化酶之间存在着密切关系，高压氧预处理作为一个预刺激，在其处理期间，可能通过自由基的增多上调神经元抗氧化酶水平，提高神经元的抗氧化能力，从而增加了对随后氧化损伤的耐受性。本实验发现，高压氧预处理组小肠黏膜血管轻微充血，少量炎性细胞浸润，微绒毛基本正常，细密，排列整齐，可见清晰的紧密连接、中间连接和桥粒。证实高压氧能够减轻大鼠肠机械屏障的缺血再灌注损伤。

MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶，主要存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中，MPO也是一种血红素蛋白，可作为中性粒细胞的特异性标记物，反映炎症损伤的程度。本实验发现，假手术组肠组织MPO活性较低，缺血再灌注组和高压氧预处理组显著增高，表明经受肠缺血再灌注后，大鼠肠组织出现明显的中性粒细胞浸润积聚，导致组织髓过氧化物酶水平显著升高。与缺血再灌注组相比，高压氧预处理组肠组织MPO活性较低，表明高压氧预处理能够显著改善中性粒细胞的浸润，减低MPO活性。活化的中性粒细胞除自身释放各种炎症介质外，还可刺激单核/巨噬细胞、淋巴细胞、肠上皮细胞及内皮细胞等产生炎症介质和细胞因子，如 TNF-α、lL-6、IL-1、lL-2、IL-8、PAF 和白细胞三烯等。Zhang等［12］研究显示，大鼠发生肠缺血再灌注损伤时，门静脉和外周血清TNF-α水平显著升高，所以，TNF-α可能是肠缺血再灌注损伤时的关键性炎症介质之一。本实验发现，与假手术组对比，缺血再灌注组和高压氧预处理组TNF-α水平显著增高，表明经受肠缺血再灌注后，血清中炎性细胞因子大量释放。与缺血再灌注组相比，高压氧预处理组血清TNF-α活性较低，提示高压氧预处理能抑制血清中炎性细胞因子释放，减轻炎症反应损伤［13］。

总之，高压氧预处理能减轻大鼠肠缺血再灌注诱导的氧化应激损伤及中性粒细胞积聚，减轻大鼠肠机械屏障的缺血再灌注损伤。高压氧预处理作为一种干预因素，能激发机体内源性保护机制，从而减轻其后所受到的组织缺血、创伤等因素引起的组织损伤，有重要的临床应用价值。

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