卢祖能，袁江，张跃亮，王云甫

胸腺基质淋巴细胞生成素诱导重症肌无力患者胸腺CD4+CD25－T细胞向CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化

卢祖能1，袁江1，张跃亮2，王云甫2

目的：探索胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）对重症肌无力（MG）合并胸腺异常患者胸腺CD4+CD25－T细胞诱导生成CD4+CD25+Foxp3+调节性T（Treg）细胞的研究。方法：以磁珠分选的方法得到胸腺CD4+CD25－T细胞及树突状细胞（DC）细胞，通过不同浓度（0.1、1、10、20 ng/mL）的TSLP活化DC后诱导CD4+CD25－T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化，以流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞/ CD4+T细胞比率；RT-PCR检测Foxp3 mRNA表达；Western blot法检测上调的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的Foxp3蛋白表达；ELSIA法检测培养上清IL-10的含量。结果：10 ng/mL TSLP组、20 ng/mL TSLP组经诱导后CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞/CD4+T细胞比例均明显升高，Foxp3的表达水平也相应增加，IL-10水平升高，与PBS对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：TSLP可以诱导MG合并胸腺异常患者胸腺CD4+CD25－T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化，并促进Foxp3的表达。

重症肌无力；胸腺基质淋巴细胞生成素；调节性T细胞

重症肌无力（mysasthenia gravis，MG）是一种累及神经-肌肉接头突触后膜上乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR），并由AChR抗体介导的细胞免疫依赖、补体参与的自身免疫性疾病[1]。MG的发病与胸腺异常有密不可分的关系，胸腺是中枢免疫耐受的起源，胸腺调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）能诱导自身反应性T淋巴细胞无能或抑制其增殖，从而维持正常的免疫稳态[2]。胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是由胸腺上皮细胞分泌的白细胞介素7（interleukin 7，IL-7）样细胞因子，前期已有研究证明TSLP能在正常胸腺组织中通过活化树突状细胞（dendritic cells，DC）诱导Treg细胞的分化成熟[3]，且MG合并胸腺瘤患者的胸腺TSLP的表达及Treg细胞的数量下降[4,5]。本研究通过体外使用TSLP干预体外培养MG患者合并胸腺瘤患者的胸腺细胞，观察Treg细胞的变化情况，为MG的特异性治疗寻找一条新的途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年7月至2014年7月于湖北医药学院附属太和医院就诊的确诊MG合并胸腺瘤患者7例[6]，男3例，女4例；胸腺切除之前均未行免疫抑制治疗，近期无感染；排除其他自身免疫性疾病和近期感染性疾病病史，且无自身免疫性疾病家族史。胸腺切除术后观察胸腺标本病理变化为胸腺增生（3例）及胸腺瘤（4例），取患者胸腺组织，分离胸腺组织中DC细胞及CD4+CD25－T细胞进行研究。本研究方案已通过医院伦理委员会审查，并经患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞及DC细胞磁珠分选试剂盒、LD柱、MS柱（购于德国Miltenyi Biotec公司），标记为FITC-CD4、PE-CD25及PCH101PE-CY5-Foxp3及Foxp3 Fixation／Permeabilization Concentrateand Diluent（均购于美国eBioscience公司），流式细胞仪（购于美国Beckman Coulter公司），细胞总RNA提取试剂Trizol、RT-PCR扩增试剂盒（购于日本Takara公司），Foxp3和β-actin引物（购于华大基因有限公司），小鼠抗人Foxp3单克隆抗体（购于美国Sigma公司），兔抗人β-actin多克隆抗体（购于博奥森公司），蛋白酶抑制剂Cocktail（购于瑞士Roch公司）、BCA蛋白定量试剂盒（购于美国Thermo公司），化学发光试剂盒（购于美国Perinelmer公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞分离磁珠分选胸腺中DC细胞及CD4+CD25－T细胞。胸腺单个核细胞制备：取MG患者胸腺瘤组织，机械破碎，金属网过滤，梯度离心法，制备胸腺单个核细胞悬液，PBS悬浮细胞。CD4+CD25－T细胞分离：悬浮细胞中加入适量的生物素标记的抗体混合物（包括生物素标记的抗小鼠CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCR以及血型糖蛋白A），混匀，4℃避光孵育10 min。后加入抗生物素磁珠以及PE标记的抗CD25抗体，混匀，4℃避光孵育20 min，洗涤1次后悬浮细胞，用LD柱（Midi分离器）分离出没有标记的CD4+T细胞群。悬浮所得细胞，加入抗PE磁珠，混匀，4℃避光孵育15 min后洗涤细胞，用MS柱（Mini分离器）分离出CD4+CD25－T细胞和CD4+CD25+Treg细胞。DC细胞分离：单个核细胞悬液加入抗CD11c磁珠，4℃避光孵育15 min。用MS柱放入MACS分离器槽中，500 μL分选BSA湿润分选柱，细胞通过分选柱，500 μL分选BSA冲洗分选柱3次。从MACS分离器槽中取下分选柱，用500 μL含10%FBS的RPMI1640冲洗分选柱，冲洗液即得到分选后的DC细胞。

1.3.2 淋巴细胞活力测定利用台盼蓝染色法评价淋巴细胞活性，各取90 μL细胞悬液，加入4 g/L台盼蓝10 μL，于显微镜下计数200个细胞，计算淋巴细胞活力。

1.3.3 不同浓度的TSLP活化DC细胞诱导Tregs分化取分离好的CD4+CD25－T细胞接种于24孔板，另取分离好的DC细胞接种于96孔板中，每孔100 μL，设为不同浓度的TSLP组（0.1、1、10、20 ng/mL）和PBS对照组。在37℃、5% CO2孵箱中培养24 h，将不同浓度的TSLP活化的DC细胞离心后，分别加入24孔板中的CD4+CD25－T细胞中，置37℃、5%CO2孵箱中培养共7 d，收集细胞培养上清，使用ELISA法进行IL-10检测，收集细胞进行流式细胞仪、RT-PCR及Western blot检测。

1.3.4 流式细胞仪检测收集细胞，离心弃上清液并用PBS洗3次，调整细胞数为1×106/mL。取100 μL细胞悬液，加入直标抗体CD4-FITC和CD25-PE各1 μL，4℃避光孵育30 min，加2 mL流式染色液，洗涤，300 g/min离心弃上清，重复1次，加入1 mL Foxp3 Fixation/permeabilization工作液，轻柔吹打均匀，固定细胞，4℃避光孵育30 min，每管加2 mL permeabilization buffer，室温下以300 g/min离心5 min，弃上清，重复1次，加100 μL permeabilization buffer重悬细胞后，加入细胞内染色抗体Foxp3-PE-CY5，室温避光孵育20 min，以permeabilization buffer 2 mL洗1次，300 g/min室温离心5 min，弃上清，加流式染色液2 mL，300 g/min室温离心5 min，弃上清，500 μL流式染色液重悬细胞，此后以流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+/CD4+表达百分率，以CD4+CD25+Foxp3+/CD4+表达百分率计为Treg细胞的相对表达水平。

1.3.5 RT-PCR检测Foxp3 mRNA的表达按RT-PCR操作说明进行具体操作。

Foxp3上游引物（5'～3'）为TGACCAAGGCTTCATCTGTG，下游引物（5'～3'）为GAACTCTGGGAATGTGCTGTT，Tm值为51.2℃，产物大小176 bp。β-actin上游引物（5'～3'）为CCTTGGTAGTGGATAATGGGTC，下游引物（5'～3'）为CATAACGCCCTGGTGTCG，Tm值为51.4℃，产物大小113 bp。反应程序：95℃，10 min（95℃，15 s；60℃，45 s）× 30；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；60℃，15 s。

1.3.6 Western blot检测培养后细胞Foxp3蛋白表达的检测收集培养细胞，裂解提取细胞总蛋白，测量蛋白浓度。SDS-PAGE电泳约2 h；半干转至硝酸纤维素膜，5%BSA常温摇床封闭1 h，与Foxp3抗体4℃孵育过夜；TBST洗膜与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG室温孵育1 h；ECL化学发光检测蛋白信号，置凝胶成像仪中曝光。

1.3.7 细胞悬液上清IL-10测定取培养后细胞4℃、3 000 r/min，离心10 min，收集上清，－80℃保存。上清液IL-10的测定采用ELISA法，检测过程按操作说明进行。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 TSLP可诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的产生，提高CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞/CD4+T细胞的比例

采用不同浓度（0.1、1、10、20 ng/mL）的TSLP作用于DC细胞24 h，离心后与前期分离的CD4+CD25－T细胞共培养，培养7 d后发现可使得部分反应体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞/CD4+T细胞的比例明显上调。PBS对照组的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞/CD4+T细胞比例为（3.01±0.61）%，10 ng/mL TSLP组为（9.79±1.73）%，20 ng/mL TSLP组为（10.80±1.39）%，与PBS对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）；0.1 ng/mL TSLP组为（3.00±0.56）%、1 ng/mL TSLP组为（3.01±0.52）%，与PBS对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

2.2 TSLP活化DC细胞诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞Foxp3 mRNA表达

TSLP活化DC细胞诱导细胞的比例明显上调，为证明上调的为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞，本研究使用RT-PCR法检测上调的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞Foxp3 mRNA的表达水平。Foxp3 mRNA表达的半定量结果以Foxp3/β-actin吸光度的相对比值计算。PBS对照组细胞中Foxp3的表达水平很低，相对定量为（1.31±0.02）；10 ng/mL TSLP组中Foxp3 mRNA表达相对量为（4.48±0.33），20 ng/mL TSLP组为（6.41±0.56），与PBS对照组相比有显著性差异（P＜0.01）；0.1 ng/mL TSLP组和1 ng/mL TSLP组中Foxp3表达水平分别为（1.48±0.12）、（1.66±0.11），与PBS对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

2.3 TSLP活化DC细胞诱导CD4+CD25+T细胞Foxp3的蛋白表达

采用Western blot检测上调的CD4+CD25+Foxp3Treg细胞Foxp3蛋白的表达，PBS对照组细胞中Foxp3蛋白的表达水平很低，相对定量为（0.290±0.006）；10 ng/mL TSLP组中Foxp3蛋白表达相对量为（0.610±0.003），20 ng/mL TSLP组为（0.680±0.002），与PBS对照组相比有显著性差异（P＜0.01）；0.1 ng/mL TSLP组和1 ng/mL TSLP组中Foxp3蛋白表达水平分别为（0.330±0.006）、（0.390±0.003），与PBS对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

2.4 细胞悬液上清IL-10的ELSIA检测

PBS对照组、0.1 ng/mL TSLP组、1 ng/mL TSLP组、10 ng/mL TSLP组、20 ng/mL TSLP组的IL-10水平分别为（21.11±5.87）、（21.92±4.62）、（22.67± 5.16）、（58.89±15.84）、（62.07± 15.75）pg/mL；与PBS对照组比较，10 ng/mL TSLP组、20 ng/mL TSLP组的IL-10显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），1 ng/mL TSLP组、0.1 ng/mL TSLP组差异无统计学意义(P＞0.05）。

图1 各组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞/CD4+T细胞比例比较

图2 各组Foxp3 mRNA的PCR扩增（A)及分析（B）结果

图3 各组Foxp3蛋白Western-blot（A）及分析（B）结果

3 讨论

MG是一种免疫介导的影响神经肌肉-接头的T细胞依赖的自身免疫性疾病，胸腺作为细胞免疫起源地，其病理改变与MG发病之间的关系密不可分[6]。免疫学研究发现胸腺T细胞的起源、发育及迁移与胸腺的微环境有相关性，在出现病理改变的胸腺组织中，胸腺微环境的变化对T细胞的增殖、分化影响明显，在DC进行抗原呈递，存在针对AChR的自身反应性T细胞以及相关B细胞分泌的抗AChR抗体[7]。正常胸腺可通过阴性选择和阳性选择去除对自身抗原有高亲和力的自身反应性T细胞，也可以通过胸腺来源的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在外周组织中发挥抑制效应即成为实现外周免疫耐受的重要途径，而CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞主要在胸腺组织中产生，并迁移到外周血中，通过细胞接触的方式分泌具有抑制功能的可溶性细胞因子，如IL-4、IL-10、转化生长因子（transforming growth factors，TGF）-β等，能够有效抑制CD4+自身反应性T细胞的增殖，维持正常外周耐受的稳态[8]。其中Foxp3在Treg细胞发育分化过程中可诱导CD4+CD25－T细胞向CD4+CD25+T细胞转化，在生物学结构上也是Treg细胞能够发挥免疫抑制效应的必备条件[9]，当Foxp3缺失时Treg细胞的免疫抑制功能会严重减弱。

TSLP是一种IL-7样细胞因子，是DC的最特异和最强效的活化因子，此前曾有研究表明人TSLP在依赖CD11c+DC的情况下促进CD4+CD25－胸腺细胞分化为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞，成功诱导CD4+CD25－胸腺细胞向Treg细胞方向分化[3]。这提示胸腺微环境下，TSLP以DC为中介，能够有效地诱导结构和功能完备的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的产生。有研究表明正常胸腺Hassall小体内及周围间质有大量的TSLP表达，而MG患者胸腺发生增生和胸腺瘤改变，髓质部结构完整的Hassall小体数目减少，TSLP表达水平亦下降[4]。且DC散在分布于增生的细胞间，DC与TSLP相互联系的空间结构被破坏，TSLP表达不足加之缺少了DC的中介作用，影响到Treg细胞正常的发育过程，从而导致MG发生[10]。在自身免疫型糖尿病小鼠模型中通过重组TSLP诱导骨髓来源的DC，成功诱导天然T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化，从而缓解糖尿病症状[11]。Lliev等[12]研究发现，肠道上皮细胞产生的TGF-β、RA、TSLP都参与致耐受DC的产生，在缺乏TSLP时，DC诱导Foxp3+Treg细胞分化的能力可由16.4%降至12.5%，补充外源性TSLP可使该功能恢复。

课题前期实验发现胸腺瘤及胸腺增生患者胸腺TSLP表达下降[4,10]，但TSLP能否诱导MG合并胸腺瘤患者Treg细胞产生，目前无相关实验证明。本实验使用MG合并胸腺瘤患者的胸腺细胞进行培养，在增加外源性TSLP表达的情况下，通过活化DC后诱导CD4+CD25－胸腺细胞分化为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞，在较高浓度（10 ng/mL、20 ng/mL）的TSLP下，与对照组相比，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞/CD4+细胞的比例升高，Foxp3的mRNA及蛋白表达均明显升高（P＜0.05），提示在TSLP表达增加的情况下，MG合并胸腺瘤患者的胸腺细胞可通过DC的中介诱导Treg细胞的分化成熟，为下一步探索分化成熟的Treg细胞免疫抑制功能及体外实验性自身免疫性重症肌无力小鼠实验打下基础。

综上所述，本实验结果表明，通过对MG合并胸腺瘤患者的胸腺CD4+CD25－细胞进行培养，在增加TSLP的情况下，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量及Foxp3的表达增加，但增加的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的抑制功能，及对MG患者的肌无力症状有无改善，尚需进一步研究证实。

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（本文编辑：王晶）

Differentiation of Intrathymic CD4+CD25－T Cells to CD4+CD25+Foxp3+Regulatory T Cells Induced by Thymic Stromal Lymphopoietin in Myasthenia Gravis Patients

LU Zu-neng,YUAN-Jiang,ZHANG Yue-liang,WANG Yun-fu.Department of Neurology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective:To investigate the effect of thymic stromal lymphopoietin(TSLP)on the differentiation of intrathymic CD4+CD25－T cells to CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in myasthenia gravis(MG)patients with abnormal thymus gland.Methods:Intrathymic CD4+CD25－T cells and dendritic cells isolated by immunomagnetic beads on MiniMACS device were co-cultured with different concentrations of TSLP(0.1,1,10,20 ng/mL)for 7 days.The ratio of CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T cells was tested by flow cytometry.The expression of Foxp3 mRNA and protein was measured by RT-PCR and Western blot respectively.The concentration of serum IL-10 was detected by ELISA.Results:The ratio of CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T cell,the expression of Foxp3 mRNA and protein,and the level of IL-10 was increased significantly in groups with 10 ng/mL and 20 ng/mL TSLP compared with those in the PBS control group(P＜0.05).Conclusion:TSLP may induce the differentiation of intrathymic CD4+CD25－T cells to CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in MG patients with abnormal thymus gland and up-regulate the expression of Foxp3.

myasthenia gravis;thymic stromal lymphopoietin;regulatory T cells

R741;R746.1

ADOI10.3870/sjsscj.2015.02.013

1.武汉大学人民医院神经内科
武汉430060
2.湖北医药学院附属太和医院神经内科
湖北十堰442000

湖北省教育厅重点项目

（No.D20112102）；湖北省科技厅自然科学基金

（No.2010CDB091 03）

2014-11-06

王云甫

wyfymc@163.com